Name: rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility
Uploaded: 2017-04-13T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Subvenções: NS088206 e ES026892. O W. Eugene e Linda Lloyd cadeira dotada para AGK e Deans Professorship para AK também são reconhecidas.

O uso dos animais e procedimentos protocolares foram aprovados e supervisionados pela Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Estadual de Iowa (Ames, IA, EUA) 1. Crescimento de culturas gliais mistas <ol><li> Decapitar 1- filhotes de 2 dias de idade rapidamente com uma tesoura que operam 5,5 polegadas, e colocar as cabeças imediatamente em um tubo de 50 ml em gelo. Note que esta decapitação é o modo de eutanásia. </li><li> Num capuz de fluxo de ar ...

<ol>
	<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>Prinz, M., Priller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+brain+macrophages+in+the+molecular+age:+from+origin+to+neuropsychiatric+disease.">Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).</li><li>Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+derive+from+progenitors,+originating+from+the+yolk+sac,+and+which+proliferate+in+the+brain.">Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain.</a> Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).</li><li>Ransohoff, R. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+thrombin+receptor+modulates+inflammation+and+astrogliosis+to+improve+recovery+after+spinal+cord+injury.">Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury.</a> Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).</li><li>Ay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+epigenetic+regulation,+and+functional+characterization+of+Prkd1+gene+promoter+in+dopaminergic+cell+culture+models+of+Parkinson's+disease.">Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease.</a> J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).</li><li>Gordon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cdelta+upregulation+in+microglia+drives+neuroinflammatory+responses+and+dopaminergic+neurodegeneration+in+experimental+models+of+Parkinson's+disease.">Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).</li></ol>

Mais antigos métodos de isolamento microgliais têm recuperações limitados que não são apropriados para diversas análises de proteína por transferência de Western e análise de RNA por qRT-PCR. A adesão diferencial e métodos tripsinização leves são duas abordagens comuns, com baixos rendimentos microgliais 13, 14, 15. A abordagem baseada em CD11b coluna também tem baixa recuperação, mas consegue uma maior pureza...

Microglia são macrófagos residentes Myb-independentes de origem mesodérmica, que diferenciam a partir de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores nas ilhas de sangue do saco vitelino 1, 2. Uma vez que a microglia embriológicos colonizaram o sistema nervoso central (SNC), que a transição de uma para uma forma amebóide ramificado 3. Estes microglia adultos são classificados como surveillant desde suas ramificações dinâmicas sondar o parênquima cerebral saudável para potenciais insultos 4. Embora microglia só contribuem para aproximadamente 10% da população de células do SNC, a sua capacidade de telha entre si assegura varrimento máxima do parênquima 4, 5. Padrões perigo-associados moleculares (amortece), tais como α-sinucleína 6, 7 e 8-amilóide β, ou ppadrões moleculares athogen-associados (PAMP), tais como lipopolissacáridos (LPS) 9, classicamente activar microglia para promover uma resposta inflamatória, caracterizada pela reversão para o estado activo amebóide e a produção de óxido nítrico, factor de necrose tumoral-α (TNF?), 1β interleucina ligando (IL-1β), IL-6, IL-12, e o motivo de quimiocina CC 2 9, 10, 11. Em condições neuro-inflamatórias, tais como a doença de Parkinson, em que patogénico α-sinucleína acumulou, um ciclo neurodegenerativa é criada a partir da morte de neurónios dopaminérgicos, que libertam mais agregado α-sinucleína, promovendo ainda mais a activação de microglia clássica 7. Semelhante aos macrófagos periféricos, microglia pode também ter a capacidade para activar, alternativamente, na presença das citocinas anti-inflamatórias de IL-4 e IL-10, dando-lhes a potenteial de promover a reparação neural e atenuar a inflamação 2, 11. Para além das suas funções imunológicas no SNC, microglia foram descritos como reguladores vitais do circuito neuronal pela poda sinapses durante o desenvolvimento. Por exemplo, os ratinhos KO Cx3cr1- têm microglia menos densas e reduzida poda sináptica, o que leva a um excesso de espinhas dendriticas, sinapses imaturas, e os padrões electrofisiológicas de um CNS subdesenvolvida 12. Compreender estas complexidades fisiológicas e os diversos papéis funcionais da microglia na homeostase do SNC é crítica para a procura de agentes terapêuticos alvo desordens neurodegenerativas. Na área de neuroimmunology, em experiências in vitro são altamente desejável por causa da maior viabilidade para estudos mecanicistas, os mais baixos custos de manutenção, e por ser menos tempo e trabalho intensivo. Furthermore, a capacidade para isolar populações de células é crítica para delinear a funcionalidade dessas células alvo sob condições prescritas. Existem numerosos métodos de isolamento microgliais, mas são limitadas pela sua capacidade para obter números relativamente elevados e pureza para a experimentação 13, 14, 15. Por exemplo, um aglomerado de diferenciação 11b (CD11b) é um marcador de superfície comum de monócitos, macrófagos, e microglia 16. Através da exploração de CD11b, um método de separação magnética foi descrito pela primeira vez como uma abordagem baseada em coluna que produziu ~ 99,5% de pureza e ~ 1,6 x 10 6 por microglia cerebral neonatal 17. O nosso laboratório desenvolvido recentemente um método de separação magnética CD11b livre de coluna 15, o que foi realizado num tubo de poliestireno por marcação CD11b com um anticorpo monoclonal conjugado com ficoeritrina (PE). A seconda biespecï¿½icaanticorpo ry a PE e complexos de dextrano com o PE. Uma vez ligado, partículas magnéticas revestidas com dextrano são introduzidos, os quais se ligam ao fim de dextrano do complexo anticorpo. Por fim, o tubo de poliestireno é colocado em um íman para o isolamento da microglia. Esta abordagem duplicou o rendimento de ~ 3,2 x 10 6 por microglia do cérebro neonatal, mas à custa de reduzir a pureza de ~ 97%. Aqui, demonstramos uma coluna isenta de CD11b protocolo de separação magnética rápida e refinado (Figura 1). Este método melhorado permanece como viável como o nosso método isento de coluna original já que o preço do kit de separação magnética CD11b é o mesmo. O tempo de conclusão é reduzido para metade, o que pode ser crucial para maximizar a sobrevivência das células e o rendimento. Notavelmente, a pureza conseguida por este método é optimizado ~&gt; 99%, uma melhoria significativa sobre a pureza obtida a partir do método isento de coluna original desenvolvido pelo nosso laboratório 15. Mais importante ainda, CD11b-PEnão é utilizado, eliminando a necessidade de incubar ao abrigo da luz e permitindo o uso do canal de vermelho para a microscopia de fluorescência. Por último, tal como no método CD11b original, uma fracção astrocítica de elevado rendimento e pureza é obtida com este método melhorado. Os astrócitos são as mais numerosas células gliais no sistema nervoso central, levando à idéia de que as suas funções homeostáticas são indispensáveis em relação à fisiopatologia 18. Estas células gliais desempenhar um papel em diversas funções fisiológicas, tais como a formação da barreira sangue-cérebro, proporcionando suporte de nutrientes, mantendo neurotransmissor homeostase, formando cicatrizes gliais em resposta a uma lesão, a neuroproteco, a aprendizagem e a memória, e neuroinflamao, exemplificando o seu potencial de investigação no glial biologia 19. Morfologia e funcionalidade da microglia e astrócitos foram verificados através de microscopia confocal, transfercia de Western, quantitativo em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR), Lensaio de nitritos Riess, e o ensaio multiplex citocina Luminex. O refinamento fornecida por este protocolo oferece maior confiança relativos à pureza da microglia ou astrócitos, a aplicação mais ampla da microscopia de fluorescência com a disponibilidade do canal de vermelho, e economiza tempo, todos os quais são importantes para experimentação in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>EasySep CD11b Separation Kit II</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11330057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (100x)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13H469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and refined cd11b magnetic isolation of primary microglia with enhanced purity and versatility

Microglia são os principais respondedores a insultos do sistema nervoso central; no entanto, muito permanece desconhecido sobre o seu papel na regulação da neuroinflamação. Microglia s culas da mesoderme que funcionam de forma semelhante aos macrófagos na topografia de stress inflamatório. O (M1-type) clássica e alternativa (do tipo M2) ativações de macrófagos também foram estendidos para microglia em um esforço para melhor compreender a interação subjacente estes fenótipos têm em condições neuroinflamatï¿½ios como Parkinson, Alzheimer e doença de Huntington. Em experiências in vitro, utilizando a microglia primário oferece resultados rápidos e fiáveis, que podem ser estendidos para o ambiente in vivo. Embora esta seja uma clara vantagem sobre a experimentação in vivo, isolando microglia ao conseguir rendimentos adequados de pureza óptima tem sido um desafio. Os métodos mais comuns actualmente em uso quer sofrem de baixa recuperação, baixo grau de pureza, ou ambos. Aqui, nós demmonstrar um refinamento do CD11b método de separação magnética sem colunas que atinge uma célula de recuperação elevado e pureza melhorada em metade da quantidade de tempo. Propomos este método otimizado como um modelo altamente útil de isolamento microglial primário para fins de estudar neuroinflamação e neurodegeneração.

Microglia isolado utilizando o kit de CD11b selecção positiva II têm alta pureza microglia primários de ratinho foram isolados utilizando o protocolo acima mencionado e plaqueadas em lamelas de poli-D-lisina-revestidas para verificar a pureza de isolamento. Dez mil células foram plaqueadas por cavidade e análise imunocitoquimica foi efectuada utilizando molécula de adaptador se liga a cálcio ionizado 1 (Iba1) como um marc...

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Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Use of Magnetic Resonance Spectroscopy as a Tool for the Measurement of Bi-hemispheric Transcranial Electric Stimulation Effects on Primary Motor Cortex Metabolism

O Uso de Espectroscopia de Ressonância Magnética como ferramenta para a Medição do Bi-hemisféricas transcranianas Estimulação Elétrica Efeitos sobre Motor Primário Cortex Metabolismo

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a neuromodulation technique that has been increasingly used over the past decade in the treatment of ...

Neurociência

Effects of Transcranial Alternating Current Stimulation on the Primary Motor Cortex by Online Combined Approach with Transcranial Magnetic Stimulation

Efeitos da estimulação da corrente alternada transcraniana no córtex Motor primário por on-line abordagem combinada com estimulação magnética transcraniana

Transcranial Alternating Current Stimulation (tACS) is a neuromodulatory technique able to act through sinusoidal electrical waveforms in a specific ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolamento e extração de RNA de neurônios, macrófagos e Microglia de Zebrafish Larval cérebros

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

Isolação rápida de macrófagos dorsal do gânglio da raiz

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Isolation and Culture of Primary Neurons and Glia from Adult Rat Urinary Bladder

Isolamento e Cultura dos Neurônios Primários e Glia da Bexiga Urinária de Ratos Adultos

The lower urinary tract has two main functions, namely, periodic urine storage and micturition; these functions are mediated through central and ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Isolamento Magnético de Células Microgliais de Rato Neonato para Culturas Celulares Primárias

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Culturas Primárias de Astrócitos de Rato e Microglia e Seu Uso no Estudo da Esclerose Lateral Amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...