Name: determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00
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この作品は国立科学評議会によって支えられたし、技術 (CONACYT)、メキシコ、研究のデザインに参加せずに PEI CONACYT 2015 220333 を付与します。

1 ですメディアとソリューションの準備 <ol><li>培養液の準備: 10% RPMI 1640 FBS、pH 7.4。</li>。
	<li>準備アッセイ培: RPMI 1640 フェノールレッドなく 1 %fbs、pH 7.4</li>。
	<li>セル洗浄ソリューションを準備: 0.02 %edta、pH 7.4 DPBS Mg と Ca 無料ソリューションです</li>。
	<li>細胞剥離液の準備: 1 mm EDTA 0.125% トリプシン。
	<ol><li>100 mL のトリプシン-EDTA ?...

<ol>
	<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+A+Review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: A Review of programmed cell death.</a> Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Darwish, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+of+apoptosis+in+regularly+dividing+cells.">Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells.</a> Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).</li><li>Tracey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+antagonist+mechanism+of+action:+A+comprehensive+review.">Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review.</a> Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).</li><li>K&#246;rner, H., Sedgwick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+necrosis+factor+and+lymphotoxin:+Molecular+aspects+and+role+in+tissue-specific+autoimmunity.">Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity.</a> Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).</li><li>Wong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFa+blockade+in+human+diseases:+Mechanisms+and+future+directions.">TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions.</a> Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).</li><li>Furst, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+TRAIL+death+receptors+DR4+and+DR5+by+the+signal+recognition+particle.">Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle.</a> Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).</li><li>Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilized+formulations+of+recombinant+tumor+necrosis+factor.">Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor.</a> Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).</li><li>Ponnappan, S., Ponnappan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+immune+function:+molecular+mechanisms+to+interventions.">Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions.</a> Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).</li><li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes.">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li><li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark:+a+potential+therapeutic+use.">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li><li>M&#228;nnel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide.">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li><li>Lis, K., Kuzawi&#324;ska, O., Ba&#322;kowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge.">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li></ol>

この特性は、高価な時間のかかる臨床試験を実施する前に事前開発中の分子の生物学的挙動を決定するのに役立ちます。また、バッチのリリースの承認薬製品のことをお勧めします。これらの試いる分子は、その作用メカニズムに関する適切な生物学的効果を持っている場合を判断するのに役立つことを言及する価値があります。このチュートリアルで提供されるバイオ分析法が異な?...

生物学的効力量 (質量で表される) は蛋白質の物理化学的測定に対し関連する生物学的特性にリンクされている製品の試金される属性に基づいて生物学的活性の定量的な尺度であります。他の分析方法論とともに、効力テストは、製品の適合性、安定性、および比較研究の一部として実行されます。この意味で、効力の測定、製品バッチと市場承認後臨床試験のすべての段階において重要な品質属性 (CQAs) または承認基準を満たすことを実証する使用されます。
アポトーシスはプログラムされた細胞死、細胞は、ウイルスや環境によってセルを強調しているときに感染しているときに自然に発生する要因その妥協細胞生存率と機能1,2。とりわけ、アポトーシス抑制、または生物学的中和です免疫炎症性疾患などの慢性疾患の治療を中心に、Mab の主知られている治療上のメカニズムの一つ抗 TNF 分子は p55 と p75 細胞表面の受容器3、最後に細胞をアポトーシスに導く信号経路を防ぐと腫瘍壊死因子アルファ (tnf α) の相互作用をブロックすることによってその治療特性を発揮します。
Tnf α はいくつかの慢性的な病気の4の炎症を引き起こすことができます。Tnf α は自然免疫系と疾患5のこの種の主な俳優の歩哨であるマクロファージから分泌される細胞外の環境にも。共通パスとして tnf α の規制緩和は、これらの病気の病因に関連付けられます。制御なしと一定の誘導と細胞ストレスの下では、tnf α は関節リウマチ、クローン病、その他の病理組織学的プロファイル6に繋がる細胞死と組織の変性を誘導します。
TNF とその受容体の相互作用をブロックする TNF 拮抗薬は、症状を軽減し、これらの疾患の進行を妨げるの効果的な療法としてますます使用されています。今日では、抗 TNF 製剤、広く全身さらに関与する組織の変性を防ぐ、このサイトカイン濃度を制御する使用されます。この意味で、薬の生物学的効果を達成するために特定の能力を記述するため再現性と堅牢な生物検定法を提供することが不可欠です。
中和アッセイの開発中にステップで識別されるこの議定書、クリティカルで-生物学的効力の測定に成功は強調表示されます、バイオ分析メソッドを実行するために必要なスキルに重点。このバイオ分析法は、医薬品の臨床試験済みの標準物質と比較されたとき異なるバッチまたは抗 TNF の間有用な比較情報を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">WEHI 164</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">CRL-1751</td>
			<td style="width:463px;">Fibrosarcoma cells from Mus musculus</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">30-2001</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">11835-030</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">25200-056</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">14190-136</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Recombinant Human TNF-alpha Protein</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:127px;">210-TA-020</td>
			<td style="width:463px;">Store at -20 &#176;C to -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3089803</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3007103</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Caspase-Glo 3/7 Assay kit</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:127px;">G8093</td>
			<td style="width:463px;">Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at &#8211;20 &#186;C protected fromLight</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent</td>
			<td style="width:111px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:127px;">8993-01</td>
			<td style="width:463px;">--</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Sample mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Probiomed</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Reference and Control mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Abbvie</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">89429-536</td>
			<td style="width:463px;">SpectraMax M3 Multi-Mode</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate reader Software&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">--</td>
			<td style="width:463px;">SoftMax Pro 6.3 GxP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Revco&#160;</td>
			<td>30482</td>
			<td style="width:463px;">Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Laminar Flow Hood&#160;</td>
			<td style="width:111px;">The Baker Company&#160;&#160;</td>
			<td>200256</td>
			<td style="width:463px;">Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method

このプロトコルは、抗 tnf α モノクローナル抗体を用いたマウス線維芽細胞細胞モデル (WEHI 164) における tnf α のアポトーシス活性中和の測定を示しています。さらに、このプロトコルは、融合蛋白質などの他の抗 tnf α 分子を評価に使用できます。ここで採用されている携帯電話のモデルは、追加のストレス因子が細胞培養条件 (例えば、血清剥奪) に誘導される tnf α によるアポトーシスに敏感です。この手順に関する試料調製、セル希釈、アポトーシス誘導、吸光光度測定結果をお約束する重要なキー操作を強調表示、この分析法を実行する方法を例示しています。このプロトコルでは、アポトーシス誘導および記録、低い不確かさの値につながる効率的な信号に関するベスト パフォーマンス条件を明らかにします。

(コントロール) と線量応答グラフ 
図 1は、mAb 濃度対発光応答を表します。このシグモイド関数セル換散のためのアッセイ培地のカスパーゼ 3 および 7 のリリースを例示しています。細胞死は、血清飢餓に加えて、tnf α シグナル誘導によって強化されています。したがって、抗 tnf α 分子 (mAb) は (立体障害) によって細胞の TNF 受?...

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Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody mAb by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

中和機構を用いた WEHI 164 細胞抗 TNF モノクローナル抗体の相対的な抗アポトーシス活性測定のためのプロトコルを次に示します。このプロトコルは同じ生物学的機能を持つ異なる分子の中和力を比較するのに役立ちます。

相対力、抗 TNF モノクローナル抗体 (mAb) 中和体外生物分析法を用いた TNF によって測定

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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