Name: determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00
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이 작품은 과학의 국가 위원회에 의해 지원 되었다 고 기술 (CONACYT), 멕시코 연구의 설계에 참여 하지 않고 페이 CONACYT 2015 220333를 부여 합니다.

1. 미디어와 솔루션의 준비 <ol><li>문화 매체를 준비: RPMI-1640 10 %FBS, pH 7.4.</li>
	<li>준비 분석 결과 문화 매체: RPMI-1640 페 놀 레드 하지 않고 있지만 1 %FBS, pH 7.4.</li>
	<li>세포 세척 솔루션 준비: DPBS Mg 및 Ca 무료 솔루션 0.02 %EDTA, pH 7.4.</li>
	<li>세포 분리 솔루션 준비: 1 mm EDTA 0.125 %trypsin.
	<ol><li>녹여 100 mL의 트립 신-EDTA와 메 마른 500 mL 플라스 크에...

<ol>
	<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+A+Review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: A Review of programmed cell death.</a> Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Darwish, R. 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이 특성화 비싸고 시간이 많이 걸리는 임상 시험 실시 전에 선험적으로 개발 중인 분자의 생물 학적 행동 결정에 도움이 됩니다. 승인 된 약 제품의 일괄 처리를 일괄 처리 릴리스도 유용합니다. 이 분석 실험 분자는 그것의 행동의 메커니즘에 대 한 적절 한 생물학적 효과 여부를 확인 하는 데 유용은 언급 가치가 있다. 이 자습서에 바이오 분석 방법은 다른 안티-TNFα 분자의 비교에 매우 중...

생물 학적 힘 수량 (대량 표현)는 단백질 함량의 물리 화학적 측정 관련 생물 속성에 연결 된 분석 제품 특성에 따라 생물 학적 활동의 양적 척도 이다. 다른 분석 방법론을 함께 힘 테스트 제품 적합성, 안정성, 및 comparability 연구의 일부로 수행 됩니다. 이런이 의미에서 힘 측정 제품 배치에 맞는지 중요 한 품질 특성 (CQAs) 또는 승인 기준 및 시장 승인 후 임상 시험의 모든 단계를 설명 하는 데 사용 됩니다.
Apoptosis는 프로그램된 한 세포 죽음, 그 타협 세포 생존 능력 및 기능1,2요소 바이러스 또는 세포는 환경에 의해 스트레스 세포 감염 때 자연스럽 게 발생. 다른 가운데, apoptosis 억제, 또는 생물 학적 중화 면역 중재 염증 성 질환 등 만성 질환의 치료에 특히 mAbs의 주로 알려진된 치료 메커니즘 중 하나입니다. 안티 TNFα 분자는 p55 p75 세포 표면 수용 체3, 마지막으로 세포 apoptosis 이어질 신호 경로 방지와 종양 괴 사 인자 알파 (TNFα)의 상호 작용을 차단 하 여 그들의 치료 속성을 발휘 한다.
TNFα 일부 만성 질환4에 염증을 일으킬 수 있다. TNFα 쓰레드가 extracellular 환경에 타고 난 면역 체계와 질병5의이 종류에 있는 주요 배우의 보초는 대 식 세포에 의해 은닉 된다. 일반적인 경로로 TNFα 규제 완화는 이러한 질병의 병 인 연결 됩니다. 제어 없이 및 지속적인 유도 및 세포 스트레스, TNFα 궁극적으로 류 마티스 관절염, Crohn의 질병, 그리고 다른 병 적인 프로필6로 이어지는 세포 죽음 및 조직 변성을 유도 합니다.
TNF와 그것의 수용 체 사이 상호 작용을 차단 하는 TNF 길 항 제는 점점 징후를 줄이고 이들이 질병의 진행을 방해 하는 효과적인 치료로 사용 되었습니다. 요즘, 안티 TNFα 약 제품 추가 참여 조직의 변성 방지이 cytokine의 조직 농도 제어를 널리 사용 됩니다. 이런이 의미에서 재현 하 고 강력한 생물의 생물 학적 효과 달성 하는 약물의 특정 능력을 설명 하기 위해 제공은 필수적입니다.
이 프로토콜, 중요 한 중화 분석 결과의 개발 단계 식별-생물 학적 힘의 성공적인 측정에 대 한 강조 표시 됩니다, 바이오 분석 메서드를 실행 하는 데 필요한 기술에 특히 강조와 함께. 이 바이오 분석 방법 마약 제품을 임상 시험된 기준 물질에 비해 다른 배치 또는 안티-TNFα 사이 유용한 comparability 정보를 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">WEHI 164</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">CRL-1751</td>
			<td style="width:463px;">Fibrosarcoma cells from Mus musculus</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">30-2001</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">11835-030</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">25200-056</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">14190-136</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Recombinant Human TNF-alpha Protein</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:127px;">210-TA-020</td>
			<td style="width:463px;">Store at -20 &#176;C to -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3089803</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3007103</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Caspase-Glo 3/7 Assay kit</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:127px;">G8093</td>
			<td style="width:463px;">Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at &#8211;20 &#186;C protected fromLight</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent</td>
			<td style="width:111px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:127px;">8993-01</td>
			<td style="width:463px;">--</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Sample mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Probiomed</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Reference and Control mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Abbvie</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">89429-536</td>
			<td style="width:463px;">SpectraMax M3 Multi-Mode</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate reader Software&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">--</td>
			<td style="width:463px;">SoftMax Pro 6.3 GxP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Revco&#160;</td>
			<td>30482</td>
			<td style="width:463px;">Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Laminar Flow Hood&#160;</td>
			<td style="width:111px;">The Baker Company&#160;&#160;</td>
			<td>200256</td>
			<td style="width:463px;">Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method

이 프로토콜 안티 TNFα mAb를 사용 하 여 마우스 fibroblast 세포 모델 (WEHI 164)에서 TNFα의 apoptotic 활동 중립화의 측정을 보여줍니다. 또한,이 프로토콜 융해 단백질 등 다른 안티 TNFα 분자를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 여기 고용 셀룰러 모델 TNFα 중재 된 apoptosis에 민감한 때 추가 스트레스 요소가 셀 문화 조건 (예: 혈 부족)에서 유도 된다. 이 절차 실행이 분석 분석 결과, 샘플 준비, 셀 희석, apoptosis 유도, 성공적인 결과 보장 하기 위해 중요 한 spectrophotometric 측정에 관련 된 주요 작업을 강조 표시 하는 방법을 예로 보여주. 이 프로토콜 apoptosis 유도 및 효율적인 신호 기록, 낮은 불확실성 값을 선도 하는 최고 성능 조건을 보여준다.

(컨트롤)와 복용량 응답 그래프 
그림 1 mAb 농도 대 발광 응답을 나타냅니다. 이 자형 기능 분석 결과 배양 세포 세포의 용 해 때문에 caspase 3 및 7 릴리스를 예로 보여주. 세포 죽음은 혈 청 기아 플러스 TNFα 유도 신호에 의해 향상 됩니다. 따라서, 안티-TNFα 분자 (mAb)는 TNF 세포 수용 체와의 상호 작용 (입체 방해)에 의해 억제 사이토카인 ...

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Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody mAb by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

프로토콜 WEHI 164 셀 중립화 메커니즘을 사용 하는 안티-TNFα mAb의 상대 안티-apoptotic 활동의 결정에 대 한 여기에 제공 됩니다. 이 프로토콜은 같은 생물 학적 기능을 가진 다른 분자의 중립화 강도 비교 하는 데 유용.

상대적인 힘의 안티-TNF 단 클론 항 체 (mAb) 중화 방 청 TNF는 시험관에서 생물 메서드를 사용 하 여의 결정

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

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