Name: determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody mAb by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национального Совета по науке и технике (КОНАСИТ), Мексика Грант PEI КОНАСИТ 2015 220333, без участия в разработке исследования.

1. подготовка средств массовой информации и решения <ol><li>подготовить питательной среды: RPMI 1640 с 10% FBS, рН 7,4.</li>
	<li>Подготовка анализа питательной среды: RPMI 1640 без фенола красного, но с 1% FBS, рН 7,4.</li>
	<li>Подготовка клетки промывочный раствор: DPBS мг и Ca бесплатно...

<ol>
	<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+A+Review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: A Review of programmed cell death.</a> Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Darwish, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+of+apoptosis+in+regularly+dividing+cells.">Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells.</a> Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).</li><li>Tracey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+antagonist+mechanism+of+action:+A+comprehensive+review.">Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review.</a> Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).</li><li>K&#246;rner, H., Sedgwick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+necrosis+factor+and+lymphotoxin:+Molecular+aspects+and+role+in+tissue-specific+autoimmunity.">Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity.</a> Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).</li><li>Wong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFa+blockade+in+human+diseases:+Mechanisms+and+future+directions.">TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions.</a> Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).</li><li>Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+antagonists:+different+kinetics+and/or+mechanisms+of+action+may+explain+differences+in+the+risk+for+developing+granulomatous+infection.">Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection.</a> Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).</li><li>Karvinen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+time-resolved+fluorescence+quenching+assay+(LANCE)+for+caspase-3.">Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3.</a> J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).</li><li>Ren, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+the+TRAIL+death+receptors+DR4+and+DR5+by+the+signal+recognition+particle.">Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle.</a> Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).</li><li>Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+CD8++T+cells+to+control+of+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).</li><li>Ramasubramanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, (2014).</li><li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+medium+and+passaging+cell+lines.">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).</li><li>Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WEHI+164+subclone+13+assay+for+TNF:+sensitivity,+specificity,+and+reliability.">WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability.</a> Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).</li><li>Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilized+formulations+of+recombinant+tumor+necrosis+factor.">Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor.</a> Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).</li><li>Ponnappan, S., Ponnappan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+immune+function:+molecular+mechanisms+to+interventions.">Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions.</a> Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).</li><li>Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+sensitization+to+TNF-induced+apoptosis+by+acute+glutathione+depletion+in+murine+hepatocytes.">Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes.</a> Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).</li><li>Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TNF+cytokine+neutralization+with+a+vNAR+from+Heterodontus+francisci+shark:+a+potential+therapeutic+use.">Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use.</a> mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).</li><li>M&#228;nnel, D. N., Falk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+induction+of+tumor+necrosis+factor+production+in+human+monocytes+requires+complete+S-form+lipopolysaccharide.">Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide.</a> Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).</li><li>Lis, K., Kuzawi&#324;ska, O., Ba&#322;kowiec-Iskra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+inhibitors-state+of+knowledge.">Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge.</a> Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).</li></ol>

Эта характеристика позволяет определить априори биологическое поведение молекулы стадии разработки прежде чем дорогим и трудоемким клинические испытания проводятся. Это также полезно для выпуска партии партии утвержденный препарат. Стоит отметить, что эти анализы являются пол?...

Биологическая потенции является количественная мера биологической активности на основе атрибутов Оксиметрический анализ продукта, которые связаны с соответствующими биологическими свойствами, тогда как количество (выраженное в массе) — физико-химические измерения содержания белка. Потенция испытания, наряду с другой аналитической методологии, выполняются как часть соответствия продукции, стабильности и сопоставимости исследований. В этом смысле потенции измерения используются для демонстрации продукта пакеты удовлетворения критических качества атрибутов (CQAs) или критерии приемки на всех этапах клинических испытаний и после утверждения рынка.
Apoptosis запрограммированная смерть клетки, естественно происходит когда клетки заражены вирусом или когда клетки подчеркнули экологической фактор что компромиссы клеточной жизнеспособности и функция1,2. Среди прочего ингибирование апоптоза, или биологического обезвреживания, является одним из главным образом известные терапевтические механизмы mAbs, особенно в лечении хронических заболеваний, таких как воспалительные заболевания иммунной системы. Анти-TNFα молекул прилагать свои лечебные свойства, блокируя взаимодействие фактора некроза опухоли альфа (TNFα) с p55 и Р75 клеток поверхности рецепторы3, таким образом предотвращая пути сигнала, которые в итоге привести к сотовой апоптоз.
TNFα могут производить воспаления в некоторых хронических заболеваний4. Ложный TNFα выделяется во внеклеточных среды макрофагами, которые являются часовых иммунной системы и основных субъектов в такого рода заболевания5. Как общий путь TNFα дерегулирование ассоциируется с патогенез этих болезней. Без контроля и под постоянным индукции и клетки стресс TNFα индуцирует смерти и тканей дегенерация клетки, в конечном счете приводит к ревматоидный артрит, болезнь Крона и другие патологические профили6.
Антагонисты ФНО, которые блокируют взаимодействие между ФНО и его рецепторов все чаще используются в качестве эффективной терапии для снижения симптоматики и препятствовать прогрессирование этих заболеваний. В настоящее время анти TNFα наркотиков продукты широко используются для управления системного концентрация этого цитокина, таким образом предотвращая дальнейшее дегенерацию связанные тканей. В этом смысле обеспечивая воспроизводимость и надежные биопроб для описания конкретных способность препарата для достижения его биологического эффекта является императивом.
В этом протоколе, критические шаги определены в ходе разработки нейтрализации пробирного-для успешного измерения биологических потенции выделяются, с особым упором на развитие навыков, необходимых для выполнения био аналитического метода. Этот био аналитический метод обеспечивает полезные сопоставимости информации между различными партиями или анти TNFα лекарственных средств по сравнению с клинически проверенных ссылка вещество.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">WEHI 164</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">CRL-1751</td>
			<td style="width:463px;">Fibrosarcoma cells from Mus musculus</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">30-2001</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">11835-030</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">25200-056</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">14190-136</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Recombinant Human TNF-alpha Protein</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:127px;">210-TA-020</td>
			<td style="width:463px;">Store at -20 &#176;C to -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3089803</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3007103</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Caspase-Glo 3/7 Assay kit</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:127px;">G8093</td>
			<td style="width:463px;">Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at &#8211;20 &#186;C protected fromLight</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent</td>
			<td style="width:111px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:127px;">8993-01</td>
			<td style="width:463px;">--</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Sample mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Probiomed</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Reference and Control mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Abbvie</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">89429-536</td>
			<td style="width:463px;">SpectraMax M3 Multi-Mode</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate reader Software&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">--</td>
			<td style="width:463px;">SoftMax Pro 6.3 GxP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Revco&#160;</td>
			<td>30482</td>
			<td style="width:463px;">Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Laminar Flow Hood&#160;</td>
			<td style="width:111px;">The Baker Company&#160;&#160;</td>
			<td>200256</td>
			<td style="width:463px;">Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method

Этот протокол показывает измерение нейтрализации деятельности apoptotic TNFα мыши модели клетки фибробластов (WEHI 164) с помощью анти TNFα МАБ. Кроме того этот протокол может использоваться для оценки других анти TNFα молекул, таких как синтез белков. Сотовая модель, работающих здесь чувствителен к TNFα-опосредованной апоптоза, когда дополнительный стресс-фактор индуцируется в условиях культуры клеток (например, лишение сыворотки). Эта процедура является примером того, как выполнить этот аналитический assay, подчеркнув основные операции, относящиеся к пробоподготовки, клетки разрежения, индукции апоптоза и спектрофотометрические измерения, которые имеют решающее значение для обеспечения успешных результатов. Этот протокол показывает лучшее исполнение условий, касающихся индукции апоптоза и эффективный сигнал записи, что приводит к низкой неопределенности значений.

Доза реакция граф (с элементами управления) 
Рисунок 1 представляет люминесценции ответ против концентрации МАБ. Эта функция сигмоид олицетворяет caspase 3 и 7 релиз в среде культуры пробирного благодаря лизис клеток. Гибель клеток усиливается с?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody mAb by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method at JoVE.com

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody mAb by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Здесь представлены протокол для определения относительной анти apoptotic активности анти TNFα МАБ, с помощью механизма нейтрализации с WEHI 164 клеток. Этот протокол полезно для сравнения нейтрализации прочности различных молекул с той же биологической функциональности.

Определение относительной силы из анти-ФНО моноклональных антител (МАБ), Neutralizing ФНО, с помощью метода Биоаналитические In Vitro

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody (mAb) by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Экзайтотоксическим Стимуляция мозга Microslices как<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель инсульта

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Возможно данио рерио Модель поликистоза почек: Нокдаун<em&gt; Wnt5a</em&gt; Причины кисты у рыбок данио почек

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Усовершенствованный метод Rapid интубации трахеи у мышей

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Метод анестезии, хирургии и сбора урожая для оценки транспедикулярных винтов с использованием<em&gt; В Виво</em&gt; Модель поясничного позвонка свиньи

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Улучшен метод для создания в Vitro гематоэнцефалического барьера модель, основанная на эндотелиальных клеток свиного мозга

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Пункция подключичной вены как альтернативный метод сбора образцов крови крыс

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine

Оптимизированная реакция Griess для UV-Vis и Голый глаз Определение противомалярийных Primaquine

Primaquine (PMQ), an important anti-malarial drug, has been recommended by the World Health Organization (WHO) for the treatment of life-threatening ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Полумапримальная инвазивная методика для индуцирования инфаркта миокарда у крыс и оценка сердечной функции изолированной рабочей системой сердца

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...