Name: determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method
Uploaded: 2017-09-16T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de ciencia y tecnología (CONACYT), México otorgar PEI CONACYT 2015 220333, sin participación en el diseño del estudio.

1. preparación de las soluciones y los medios de comunicación <ol><li>preparar el medio de cultivo: RPMI-1640 con 10% FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Preparar medio de cultivo de ensayo: RPMI-1640 sin rojo de fenol con 1% FBS, pH 7.4.</li>
	<li>Preparar la solución de lavado celular: solución de DPBS libre de Ca y Mg con EDTA 0.02%, pH 7,4.</li>
	<li>Preparar la solución de separación celular: tripsina 0,125% con EDTA 1 mM.
	<ol><li>Descongelar 10...

<ol>
	<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+A+Review+of+programmed+cell+death.">Apoptosis: A Review of programmed cell death.</a> Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Darwish, R. 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Esta caracterización ayuda a determinar a priori el comportamiento biológico de una molécula en desarrollo antes de que se llevan a cabo ensayos clínicos costosos y desperdiciadores de tiempo. También es útil para la liberación de lote a lote de un producto de droga aprobado. Cabe destacar que estos análisis son útiles para determinar si una molécula tiene un efecto biológico adecuado en cuanto a su mecanismo de acción. El método bio-analítico presentado en este tutorial es muy importante que la co...

Potencia biológica es la medida cuantitativa de la actividad biológica basada en los atributos del producto ensayado que están vinculados a las propiedades biológicas pertinentes, considerando que la cantidad (expresada en masa) es una medida fisicoquímica del contenido de proteínas. Pruebas de potencia, junto con otras metodologías analíticas, se realizan como parte de estudios de comparabilidad, la estabilidad y la conformidad del producto. En este sentido, las mediciones de potencia se utilizan para demostrar que los lotes de producto cumplen los atributos de calidad críticos (CQAs) o criterios de aceptación durante todas las fases de ensayos clínicos y después de la aprobación del mercado.
La apoptosis es muerte celular programada, que naturalmente ocurre cuando las células se infectan con un virus o cuando las células son tensionadas por un medio ambiente factor compromisos celular viabilidad y función1,2. Entre otros, inhibición de la apoptosis, o neutralización biológica, es uno de los mecanismos terapéuticos principalmente conocidos de mAbs, particularmente en el tratamiento de enfermedades crónicas, como trastornos inflamatorias inmune-mediada. Moléculas anti-TNFα ejercen sus propiedades terapéuticas mediante el bloqueo de la interacción del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) con el p55 y el p75 celular receptores de la superficie3, evitando vías de señales que finalmente conducen a la apoptosis celular.
TNFα puede producir inflamación en las enfermedades crónicas4. TNFα es secretada cifra en el medio extracelular por los macrófagos, que son los centinelas del sistema inmune innato y los principales actores en este tipo de enfermedad5. Como un camino común, desregulación del TNFα se asocia con la patogenia de estas enfermedades. Sin control y bajo inducción constante y estrés celular, TNFα induce la degeneración de tejido y muerte celular, en última instancia conducen a la artritis reumatoide, enfermedad de Crohn y otros perfiles patológicos6.
Antagonistas del TNF que bloqueen la interacción entre TNF y sus receptores se han utilizado cada vez más como una terapia eficaz para reducir la sintomatología y dificultar la progresión de estas enfermedades. En la actualidad, medicamentos anti-TNFα son ampliamente utilizados para el control de la concentración sistémica de esta citoquina, además evitando la degeneración de los tejidos involucrados. En este sentido, es imprescindible proporcionar una prueba reproducible y robusto para describir la capacidad específica de un fármaco para lograr su efecto biológico.
En este protocolo, crítico pasos identificados durante el desarrollo de un ensayo de neutralización-para la medida acertada de la potencia biológica destacan, con particular énfasis en las habilidades necesarias para ejecutar el método bio-analíticos. Este método bio-analítica proporciona información útil comparabilidad entre diferentes lotes o anti-TNFα medicamentos en comparación con una sustancia de referencia clínicamente probado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="904">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">WEHI 164</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">CRL-1751</td>
			<td style="width:463px;">Fibrosarcoma cells from Mus musculus</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">RPMI-1640 Medium</td>
			<td style="width:111px;">ATCC</td>
			<td style="width:127px;">30-2001</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">11835-030</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">25200-056</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:111px;">GIBCO</td>
			<td style="width:127px;">14190-136</td>
			<td style="width:463px;">Store medium at 2 &#176;C to 8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Recombinant Human TNF-alpha Protein</td>
			<td style="width:111px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:127px;">210-TA-020</td>
			<td style="width:463px;">Store at -20 &#176;C to -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3089803</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized</td>
			<td style="width:111px;">HyClone</td>
			<td style="width:127px;">SH3007103</td>
			<td style="width:463px;">Store at -10 &#176;C to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:203px;">Caspase-Glo 3/7 Assay kit</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:127px;">G8093</td>
			<td style="width:463px;">Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at &#8211;20 &#186;C protected fromLight</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent</td>
			<td style="width:111px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:127px;">8993-01</td>
			<td style="width:463px;">--</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Sample mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Probiomed</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:203px;">Reference and Control mAb Adalimumab</td>
			<td style="width:111px;">Abbvie</td>
			<td style="width:127px;">NA</td>
			<td style="width:463px;">Final concentrations in the microplate are:&#160; 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">89429-536</td>
			<td style="width:463px;">SpectraMax M3 Multi-Mode</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Microplate reader Software&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:127px;">--</td>
			<td style="width:463px;">SoftMax Pro 6.3 GxP</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Revco&#160;</td>
			<td>30482</td>
			<td style="width:463px;">Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Laminar Flow Hood&#160;</td>
			<td style="width:111px;">The Baker Company&#160;&#160;</td>
			<td>200256</td>
			<td style="width:463px;">Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the relative potency of an anti-tnf monoclonal antibody (mab) by neutralizing tnf using an in vitro bioanalytical method

Este protocolo indica la medida de la neutralización de actividad apoptótica de TNFα en un modelo de celular de la fibroblastos de ratón (WEHI 164) con un mAb anti-TNFα. Además, este protocolo puede utilizarse para evaluar otras moléculas anti-TNFα, tales como proteínas de fusión. El modelo de celular utilizado aquí es sensible a la apoptosis mediada por el TNFα cuando es inducida por un factor de estrés adicional en las condiciones de cultivo celular (p. ej., privación de suero). Este procedimiento es un ejemplo de cómo ejecutar este ensayo analítico, destacando las operaciones claves relativas a la preparación de la muestra, dilución celular, inducción de apoptosis y medidas espectrofotométricas que son críticas para garantizar resultados exitosos. Este protocolo revela las condiciones de mejor rendimiento relacionados con la inducción de apoptosis y eficiente de señal de grabación, llevando a valores bajo incertidumbre.

Gráfico de la respuesta a la dosis (con controles) 
La figura 1 representa la respuesta de luminiscencia frente a concentración de mAb. Esta función sigmoidal es un ejemplo de liberación de la caspasa 3 y 7 en el medio de cultivo de ensayo debido a la lisis celular. Muerte celular es realzada por inanición de suero además de TNFα inducción de señalización. Por lo tanto, la molécula anti-TNFα (mAb) interactúa con la citocina, i...

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Determination of the Relative Potency of an Anti-TNF Monoclonal Antibody mAb by Neutralizing TNF Using an In Vitro Bioanalytical Method

Aquí se presenta un protocolo para la determinación de la actividad anti-apoptótica relativa de un mAb anti-TNFα mediante un mecanismo de neutralización con células WEHI 164. Este protocolo es útil para comparar la fuerza de la neutralización de diferentes moléculas con la misma funcionalidad biológica.

Determinación de la potencia relativa de un Anti-TNF Anticuerpo Monoclonal (mAb) por neutralizante utilizando un método de bioanalítica In Vitro TNF

This protocol shows the measurement of the apoptotic activity neutralization of TNF&#945; in a mouse fibroblast cell model (WEHI 164) using an ...

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