Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Forfatterne anerkender den tekniske bistand af Abigail Harris. De erkender også Paula Cohen og Kim Holloway for at hjælpe til at optimere forbereder overflade-spredning kerner fra mus spermatocytes-protokollen. Forfatterne også sætte pris på kritisk læsning af manuskript af Karen Schindler.
Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM106262 til K.M.B.

Alle metoder der involverer mus udnyttede høje etiske og sociale standarder, og blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg på Drexel University College of Medicine.
1. forberedelse af løsninger og nødvendige instrumenter
<ol><li>Forberede Hypotonic udvinding Buffer (HEB) i 50 mL ultrarent laboratorium grade vand, pH 8.2-8.4 (tabel 1). Gøre løsning frisk hver gang, holde på is, og brug inden for 2 timer til at forberede opslag; Det er nødvendigt at optimere redukt...

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

For at opnå høje antal godt spredt, god kvalitet spermatocyte kerner, de mest kritiske skridt af denne protokol omfatter passende inkubationstiden for seminiferous tubules i HEB, passende hakning af seminiferous tubules, og teknikken ansat til at fordelt cellesuspension saccharose på den Fikseringsvæske belagt dias. Vi Inkuber seminiferous tubules fra testiklerne vildtype hanner spænder fra postnatal dag 15 til voksenliv i HEB for 45 min, mens testiklerne fra sammenligneligt alderen Chtf18-null mus inkubere...

Mus er udbredt som en model organisme for at studere meiose i pattedyr. Både normale udviklingsprocesser og fejl, der opstår under meiose kan vurderes. Tidslinjen og progression af iøjnefaldende funktioner, der opstår under prophase og substages, samt et væld af specifikke proteiner involveret i processer afgørende for reguleringen af meiosen kan karakteriseres både vildtype og mutant-mus. Flere specialiserede processer, der opstår under meiose jeg kan studeres i detaljer (gennemgik i Händel og Schimenti1). Disse omfatter DNA dobbelt-strenget pause (DSB) dannelse og reparation, rekombination, synaptonemal kompleks dannelse og kromosom adskillelse.
Et vigtigt aspekt af at studere meiotiske processer er mulighed for at undersøge kerner indeholdende homologe kromosomer, der er visuelt og optisk løst for bedre at skelne og identificere substages af prophase I. Prophase jeg består af 5 substages der er kendetegnet ved bestemte funktioner, herunder dannelsen af synaptonemal complex (SC). Overvågningsudvalget er en treparts protein stillads, der gør det muligt for parring og DNA dobbelt-strenget pause reparation af homologs. Under leptonema justere homologs aksial elementer af SC er fastsat. Derefter letter tilknytning af centrale elementer til synaptonemal komplekset under zygonema parring og fysisk forbindelse (synapsis) mellem par af homologs. Under pachynema, synapsis af homologs bliver komplet og DNA delefiltre er dannet af reparation af en udvalgt population af DNA dobbelt-strenget pauser via homologe rekombination. SC dekompilerer under diplonema, så homologs desynapse men blive siddende på deres centromeres og på lokaliteter af DNA delefiltre. Endelig under diakinesis, homologs recondense og overgangen til metafase forekommer1.
Historisk, overflade-spredning af meiotiske kromatin givet få kerner, især dem fra tidlige stadier af prophase jeg2. Som et resultat, blev disse metoder ændret for at forbedre adskillelse af celler fra væv (dvs testiklerne eller æggestokkene), sprede meiotiske kromatin teknik, og udbyttet af høj kvalitet meiotiske kerner til evaluering2,3, 4. Desuden er denne metode har vist sig for at være nyttige i at bevare nukleare og kromatin bundet proteiner i meiotiske kerner, som det fremgår af offentliggjorte immunolocalization teknikker5,6,7. Derfor, metoden oprindeligt beskrevet af Peters2 og viste her udbytter mange separate brast spermatocyte kerner indeholdende homologs gennemgår leptotene, zygotene, pachytene, diplotene og diakinesis substages af prophase jeg.
Teknik til at forberede overflade-spredning kerner (også kaldet kromatin spredning analyse) er meget udbredt at studere meiose inden for reproduktiv og cellebiologi. Dias, der indeholder overflade-spredning kerner kan efterfølgende immunostained med antistoffer mod proteiner af interesse eller underkastes sølv farvning, og derefter analyseres med mikroskopi. Metoden er den samme for både mandlige og kvindelige mus, selv om ændringer er blevet beskrevet for hunmus2. Det er afgørende ikke at overmince seminiferous tubules. Kerner skal også fordeles godt, så at følge immunfarvning homologs og tilknyttede proteiner ses tydeligt med mikroskopi. Overflade-spredning kerner kan tilberedes på blot et par timer og enten immunostained straks eller opbevares ved-80 ° C i højst 3 uger før optøning og immunfarvning. Optimale resultater fås dog bedst for nogle proteiner, hvis immunfarvning udføres straks eller senest 2 uger efter udarbejdelsen af overflade-spredning kerner. Slides kan blive immunostained med en standard-protokol ved hjælp af antistoffer mod proteiner af interesse, efterfulgt af inkubation med sekundære antistoffer konjugeret til fluorescerende proteiner eller farvestoffer, så afbildet med Fluorescens mikroskopi8. Postnatal dag 15-21 er der tilstrækkelig væv pr. par vildtype testiklerne til at give 6-10 dias, og ældre mus (herunder voksne) vil give flere dias. Dog vil vilde type mus 6 ugens i alder og ældre også give mere post meiotiske celler (dvs. spermatider) på dias efter immunfarvning. Derudover alle substages af prophase jeg kan observeres hos unge og voksne mus. Testiklerne fra hanner på postnatal dage 10 gennem 15 vil give mange flere leptotene og zygotene celler. Mus ældre end postnatal dag 14-15 vil give mere pachytene og diplotene kerner.
Her vi beskrive og dokumentere en meget udbredt metode at forberede overflade-spredning kerner fra mus spermatocytes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Pattedyr meiose er en dynamisk udviklingsproces, der forekommer i kimceller og kan studerede og karakteriseret. Ved hjælp af en metode til at sprede kerner på overfladen af dias (i stedet for at slippe dem fra en højde), vi vise en optimeret teknik på mus spermatocytes, der blev første gang beskrevet i 1997. Denne metode er meget udbredt i laboratorier til at studere pattedyr meiose, fordi det giver et væld af høj kvalitet kerner gennemgår substages af prophase I. Seminiferous tubules placeres først i en hypotonic løsning til at svulme spermatocytes. Så spermatocytes er udgivet i en rørsukkeropløsning til at oprette en cellesuspension, og kerner er spredt på fiksativ-gennemblødt glas lysbilleder. Efter immunfarvning, en mangfoldighed af proteiner germane til meiotiske processer kan undersøges. For eksempel, kan proteiner i synaptonemal-komplekset, en tredelt struktur, der forbinder kromosom akser/kerner af homologs sammen visualiseres nemt. Meiotiske rekombination proteiner, der er involveret i reparation af DNA dobbelt-strenget pauser af homologe rekombination, kan også være immunostained til at evaluere progression af prophase jeg. Her vi beskrive og vise i detaljer en teknik udbredt at studere pattedyr meiose i spermatocytes fra unge eller voksne mandlige mus.

Denne metodes evne til at levere store mængder af overfladen spredt kerner indeholdende intakt homologs afhænger af tre hovedfaktorer: 1) passende inkubationstiden for seminiferous tubules i hypotonic buffer (dvs. HEB) at opnå tilstrækkeligt svulmede spermatocyte kerner, der brast men ikke smuldre fra forlænget inkubering i HEB, 2) micropipetting saccharose dråber af celler til at opnå en adskilt suspension af kerner, der ikke er klumpet sammen og 3) vippe hver fiksativ belagt slid...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Meiose er den udviklingsmæssige proces hvorved mælke dannes ved en enkelt runde af DNA-replikation og to efterfølgende runder af kromosom adskillelse. Pattedyr meiose kan undersøges ved at benytte en teknik til at forberede meiotiske kromosom spreads. Her viser vi en metode til at forberede overflade-spredning kerner fra mus spermatocytes.

Forberedelse af meiotiske kromosom spreder sig fra musen Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromosom Forberedelse Fra dyrkede celler

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

En hurtigt Air-tør droppe kromosom fremstillingsmetode Egnet til FISH i planter

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...