Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

De auteurs erkennen de technische bijstand van Abigail Harris. Zij erkennen ook Paula Cohen en Kim Holloway voor zijn bijdrage aan het optimaliseren van het protocol van de voorbereiding van de oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten. De auteurs waarderen ook kritische lezing van het manuscript door Karen Schindler.
Dit werk werd gesteund door de NIH R01 GM106262 te K.M.B.

Alle methoden waarbij muizen gebruikt hoge ethische en sociale normen, en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité aan Drexel University College of Medicine.
1. bereiding van de oplossingen en instrumenten die nodig zijn
<ol><li>Bereiden hypotone extractie Buffer (HEB) in 50 mL ultrazuiver laboratorium rang water, pH 8.2-8.4 (tabel 1). Maak de oplossing vers telkens Houd op ijs, en gebruik binnen 2 uur van de voorbereiding van de spreads; Dit is nodig om de verminde...

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

Met het oog op een groot aantal goed verspreid, goede kwaliteit spermatocyte kernen, omvatten de belangrijkste stappen van dit protocol passende incubatietijd van seminiferous buisjes in HEB, passende hakken van seminiferous buisjes, en de techniek gebruikt om te de celsuspensie sacharose verspreid de kleefpoeders gecoate dia('s). We broeden seminiferous buisjes van testes van wild type mannetjes variërend van postnatale dag 15 naar volwassenheid in HEB voor 45 min, terwijl de teelballen van relatief leeftijd Chtf18...

Muizen worden veel gebruikt als een modelorganisme voor het bestuderen van de meiose bij zoogdieren. Zowel de normale ontwikkelings processen en de gebreken die zich tijdens de meiose voordoen kunnen worden geëvalueerd. De tijdlijn en de progressie van de meest opvallende kenmerken die zich voordoen tijdens de profase I en substages, evenals een scala aan specifieke proteïnen die betrokken zijn bij processen van cruciaal belang voor de regulering van de meiose kan gekarakteriseerd worden bij zowel wild type en mutant muizen. Verschillende gespecialiseerde processen die zich tijdens de meiose die ik kunnen bestudeerd worden in detail voordoen (herzien in Handel en Schimenti-1). Het gaat hierbij om DNA dubbele-strand break (DSB) vorming en reparatie, recombinatie synaptonemal complex vorming en chromosoom segregatie.
Een belangrijk aspect van het bestuderen van Meiotische processen is de mogelijkheid te onderzoeken van de kernen met homologe chromosomen die visueel en optisch beter worden opgelost onderscheiden en identificeren van de substages van de profase I. profase ik bestaat uit 5 substages die worden gekenmerkt door specifieke eigenschappen met inbegrip van de vorming van het synaptonemal complex (SC). De SC is een tripartiete eiwit steiger waarmee het in paren rangschikken en DNA dubbele-strand break reparatie van homologen. Tijdens leptonema uitlijnen homologen neergelegde axiale elementen voor de SC zijn. Vervolgens vergemakkelijkt gehechtheid van centrale elementen aan het synaptonemal-complex tijdens zygonema pairing en fysieke verbinding (synapsis) tussen paren van homologen. Tijdens pachynema, synapsis van homologen wordt compleet en DNA cross-overs zijn gevormd uit reparatie van een select aantal DNA dubbele-strand einden via homologe recombinatie. De SC worden ontleed tijdens diplonema, waardoor homologen te desynapse, maar blijven hun centromeren en plaatsen van de crossovers DNA. Tot slot tijdens diakinese, homologen recondense en de overgang naar de metafase treedt op1.
Historisch, oppervlakte-verspreiding van Meiotische chromatine leverde enkele kernen, vooral die uit de vroege stadia van de profase ik2. Dientengevolge, zijn deze methoden gewijzigd ter verbetering van de scheiding van de cellen van weefsels (d.w.z. testis of eierstok), de techniek van de verspreiding Meiotische chromatine, en de opbrengst van hoge kwaliteit Meiotische kernen voor evaluatie2,3, 4. Bovendien, deze methode bleek te zijn nuttig bij het behoud van nucleaire en chromatine gebonden eiwitten in Meiotische kernen, zoals blijkt uit de gepubliceerde immunolocalization technieken5,6,7. Dus de methode in eerste instantie beschreven door Peters2 en hier gedemonstreerd rendementen veel aparte burst spermatocyte kernen met homologen ondergaan van de leptotene, zygotene, pachytene, diplotene en diakinese substages van profase ik.
De techniek van de voorbereiding van de oppervlak-spread kernen (ook wel chromatine verspreiding analyse) wordt veel gebruikt om te studeren van meiose op het gebied van reproductieve en celbiologie. Dia's met oppervlak-spread kernen kunnen vervolgens immunostained met antilichamen tegen proteïnen van belang of onderworpen aan zilveren kleuring en vervolgens geanalyseerd met microscopie. De methode is vergelijkbaar voor zowel vrouwelijke als mannelijke muizen, hoewel wijzigingen voor vrouwelijke muizen2zijn beschreven. Het is belangrijk niet te overmince van seminiferous buisjes. Kernen ook goed moeten worden gespreid zodat na immunokleuring homologen en geassocieerde eiwitten zijn duidelijk gezien met microscopie. Oppervlakte-spread kernen kunnen worden in slechts een paar uur en beide immunostained onmiddellijk bereid of opgeslagen bij-80 ° C voor een maximum van 3 weken voor ontdooien en immunokleuring. Optimale resultaten worden echter best verkregen voor sommige eiwitten als immunokleuring wordt uitgevoerd onmiddellijk of binnen 2 weken na de voorbereiding van de oppervlak-spread kernen. Dia's kunnen immunostained met een standaard protocol met behulp van antilichamen tegen proteïnen van belang, gevolgd door incubatie met secundaire antilichamen geconjugeerd aan fluorescente proteïnen of kleurstoffen, dan beeld met fluorescentie microscopie8. Op postnatale dag 15-21 is er voldoende weefsel per paar van wild type teelballen opleveren van 6-10 dia's en oudere muizen (met inbegrip van volwassenen) meer dia's zal opleveren. Echter zal wild type muizen 6 weken en ouder ook meer post Meiotische cellen (d.w.z. spermatids) op de dia's na immunokleuring opleveren. Bovendien, alle substages van profase ik kan worden waargenomen in de jeugd- en volwassen muizen. De testikels van de mannetjes op postnatale dagen 10 t/m 15 levert veel meer leptotene en zygotene cellen. Muizen ouder dan postnatale dag 14 tot 15 zal het opleveren van meer pachytene en diplotene kernen.
Hier wij beschrijven en demonstreren van een veel gebruikte methode voor te bereiden oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Zoogdieren meiose is een dynamische developmental proces dat voorkomt in de geslachtscellen en kan worden bestudeerd en gekenmerkt. Met behulp van een methode te verspreiden kernen op het oppervlak van de dia's (in plaats van neer te zetten vanaf een hoogte), tonen we een geoptimaliseerde techniek op muis spermatocyten die voor het eerst in 1997 beschreven werd. Deze methode wordt veel gebruikt in laboratoria te onderzoeken zoogdieren meiose omdat het resulteert in een overvloed van hoge kwaliteit kernen ondergaan substages van profase I. Seminiferous tubuli voor het eerst in een hypotone oplossing gebracht te zwellen spermatocyten worden geplaatst. Vervolgens een sacharoseoplossing maken een celsuspensie spermatocyten vrijkomen en kernen zijn verspreid in glas fixeerspray doordrenkte dia's. Naar aanleiding van immunokleuring, een verscheidenheid van eiwitten germane Meiotische processen kan worden onderzocht. Bijvoorbeeld, de eiwitten van het synaptonemal-complex, een tripartiete structuur die de chromosoom assen/kernen van homologen samen verbindt kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd. Meiotische recombinatie eiwitten, die bij de reparatie van DNA dubbele-strand einden door homologe recombinatie betrokken zijn, kunnen ook worden immunostained om te evalueren van de voortgang van de profase ik. Hier wij beschrijven en demonstreren in detail een techniek om te studeren van zoogdieren meiose in spermatocyten van jonge of volwassen mannelijke muizen op grote schaal gebruikt.

Het vermogen van deze methode om grote aantallen oppervlak verspreid kernen met intact homologen hangt af van drie belangrijke factoren: 1) passende incubatietijd van seminiferous buisjes in hypotone buffer (d.w.z. HEB) voldoende om gepofte spermatocyte kernen die barsten, maar doen niet desintegreren van langdurige incubatie in HEB, 2) micropipetting de sacharose druppels van cellen te verkrijgen van een gescheiden opschorting van kernen die niet worden samengeklonterd samen, en 3) dia i...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Meiose is het ontwikkelings proces waaraan gameten worden gevormd door een ronde van DNA-replicatie en twee opeenvolgende ronden van chromosoom segregatie. Zoogdieren meiose kan worden onderzocht met behulp van een techniek ter voorbereiding Meiotische chromosoom spreads. Hier tonen we een methode voor te bereiden oppervlak-spread kernen van muis spermatocyten.

Voorbereiding van Meiotische chromosoom verspreidt van muis spermatocyten

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse Spleen met de gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

De voorbereiding van Drosophila polytheen Chromosoom Pompoenen voor antilichaam Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosoom Voorbereiding Van gekweekte cellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Een Fast Air-droge Dropping Chromosome Bereidingswijze Geschikt voor vissen in planten

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...