Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

המחברים להכיר את הסיוע הטכני של אביגיל האריס. הם גם מכירים כהן פאולה, קים הולוויי שעזרת כדי למטב את הפרוטוקול של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes. המחברים גם מעריך קריאה ביקורתית של כתב היד על-ידי קארן שינדלר.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM106262 כדי K.M.B.

כל השיטות מעורבים עכברים מנוצל אתיות גבוהה וסטנדרטים רווחה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל.
1. הכנה של פתרונות וכלים הדרושים
<ol><li>להכין היפוטוניק החילוץ מאגר לייצוגית ב 50 מ של מים כיתה מעבדה הנדסה גנטית, pH 8.2-8.4 (טבלה...

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

כדי לקבל מספר גבוה של איכות להפיץ. ובכן, טוב spermatocyte גרעינים, השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה לכלול זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה מצגת, המתאימה הא של וכמה בקוריאנית, והעסיק הטכניקה כדי התפזר התליה תא סוכרוז השקופיות מצופה מקבע. אנחנו דגירה בקוריאנית וכמה מן האשכים של הזכרים פראי ?...

עכברים הם בשימוש נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מיוזה ביונקים. ניתן להעריך תהליכים התפתחותיים רגילים והן פגמים להתרחש במהלך המיוזה. ניתן לאפיין את ציר הזמן ואת ההתקדמות של תכונות בולטות להתרחש במהלך prophase ו- substages, כמו גם שפע של חלבונים ספציפיים המעורבים בתהליכים מכריע רגולציה של מיוזה פראי סוג ועכברים מוטנטים. מספר תהליכים מיוחדים המתרחשים במהלך המיוזה שניתן יהיה ללמוד בפירוט (נבדקה הנדל ו Schimenti1). אלה כוללות מערך כפול-strand break (DSB) ה-DNA ותיקון, רקומבינציה, היווצרות קומפלקס synaptonemal, ו כרומוזום סגרגציה.
היבט חשוב של הלומדים תהליכים meiotic הוא היכולת לבחון גרעינים המכילים כרומוזום הומולוגי הנפתרות חזותי, שטיחות טוב יותר להבחין ולזהות את substages של prophase אני Prophase אני מורכבת 5 substages זה מאופיינים בתכונות ספציפיות, כולל הקמת המתחם synaptonemal (SC). SC הוא חלבון ה-tripartite לגרדום המאפשר שיוך ו DNA כפול-strand break לתקן של homologs. במהלך leptonema, homologs ישר כפי צירית יסודות SC ברורים. אז מצורף של אלמנטים מרכזיים למתחם synaptonemal במהלך zygonema מקלה על שיוך ופיזית חיבור (synapsis) בין זוגות של homologs. במהלך pachynema, synapsis של homologs הופך מוחלט, הדי ג'יי ג'יי אברהמס נוצרות מתוך תיקון של אוכלוסיה בחירה של מעברי כפול-גדיל DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית. SC פירוק במהלך diplonema, ומאפשר homologs desynapse אבל יישארו מצורפים centromeres שלהם ועל אתרים של הדי ג'יי ג'יי אברהמס. בסופו של דבר במהלך diakinesis, homologs recondense ומתרחשת המעבר מפה של1.
מבחינה היסטורית, השמת השטח של כרומטין meiotic הניב כמה גרעינים, במיוחד אלה של שלבים המוקדמים של prophase אני2. כתוצאה מכך, שונו שיטות אלה כדי לשפר את ההפרדה של תאים ברקמות (קרי testis או שחלה), בטכניקה של כרומטין meiotic מתפשטת, את התשואה של גרעינים meiotic באיכות גבוהה עבור הערכה2,3, 4. בנוסף, שיטה זו הוכיחה להיות שימושי בשימור גרעינית, כרומטין כרוך חלבונים גרעינים meiotic כפי שמגלה immunolocalization שפורסמו טכניקות5,6,7. לכן, השיטה בתחילה מתוארת על ידי פיטרס2 והפגינו כאן תשואות הרבה גרעינים spermatocyte פרץ נפרד המכיל homologs שעברו את substages leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ו diakinesis של prophase אני.
בטכניקה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים (נקרא גם ניתוח התפשטות כרומטין) נעשה שימוש נרחב ללמוד מיוזה בתחומי ביולוגיה הרבייה של התא. שקופיות המכילה השטח-התפשטות הגרעינים ניתן לאחר מכן immunostained עם נוגדנים חלבונים עניין או נתון צביעת כסף, ולאחר מכן נותחו עם מיקרוסקופ. השיטה זו דומה עבור עכברים גם זכר וגם נקבה, למרות השינויים שתוארו עבור עכברים הנשי2. חשוב להימנע overmince וכמה בקוריאנית. הגרעינים חייב גם להיות להתפשט כך בעקבות immunostaining homologs, חלבונים הקשורים נראים בבירור עם מיקרוסקופ. השטח-התפשטות הגרעינים ניתן מוכן תוך שעות ספורות גם immunostained מיד או המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לכל היותר 3 שבועות לפני מפשיר ו- immunostaining. עם זאת, תוצאות אופטימליות מתקבלים בצורה הטובה ביותר עבור חלבונים מסוימים אם immunostaining מתבצע באופן מיידי או בתוך 2 שבועות של הכנת השטח-התפשטות גרעינים. שקופיות יכול להיות immunostained עם פרוטוקול תקני באמצעות נוגדנים חלבונים של עניין, ואחריו הדגירה עם חלבונים מצומדת כדי פלורסנט נוגדנים משניים או צבע, ולאחר מכן עם תמונה עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ8. ב 21-15 יום לאחר הלידה יש רקמות מספיקות לכל זוג של האשכים פראי סוג להניב שקופיות 6-10, עכברים בוגרים (כולל מבוגרים) תניב עוד שקופיות. עם זאת, פראי סוג עכברים 6 שבועות של גיל ומעלה גם תניב התאים יותר פוסט-meiotic (קרי spermatids) בשקופיות בעקבות immunostaining. בנוסף, כל substages של prophase אני יכול להיות שנצפו בעכברים לנוער ומבוגרים. האשכים מן הזכרים כמחנכת ימים 10 15 תניב הרבה יותר תאים leptotene ו- zygotene. עכברים שגילם יום כמחנכת 14 עד 15 תניב יותר גרעינים pachytene ו- diplotene.
כאן אנחנו מתארים ומדגימים שיטה בשימוש נרחב של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

בתרבית של המיוזה היא תהליך התפתחותי דינמי כי מתרחשת בתאי הנבט, ניתן ללמוד מאופיין. באמצעות שיטה כדי להפיץ את הגרעינים על פני השטח של שקופיות (ולא לזרוק אותם מגובה), נדגים שיטת אופטימיזציה על העכבר spermatocytes אשר תוארה לראשונה בשנת 1997. בשיטה זו נעשה שימוש נרחב במעבדות ללמוד בתרבית של המיוזה כי זה מניב שפע של גרעינים איכותיים שעברו substages של prophase אני וכמה בקוריאנית ממוקמים תחילה בתמיסה היפוטוניק להתנפח spermatocytes. ואז spermatocytes משתחררים אל פתרון סוכרוז ליצירת השעיה תא, גרעינים פזורים על גבי מדרון זכוכית ספוג מקבע. בעקבות immunostaining, מגוון של חלבונים שהם נוגעים לתהליכים meiotic יכולים להיבדק. לדוגמה, חלבונים של המתחם synaptonemal, מבנה התלת-צדדי המחבר בין כרומוזום הצירים/הליבות של homologs יחד, ניתן בקלות לאבחן. רקומבינציה meiotic חלבונים, אשר מעורבים תיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית, יכול להיות גם immunostained כדי להעריך את ההתקדמות של prophase אני. כאן אנחנו מתארים ומדגימים בפירוט טכניקה בשימוש נרחב ללמוד בתרבית של מיוזה ב spermatocytes של נער או מבוגר זכר עכברים.

היכולת של שיטה זו לספק מספר רב של השטח להפיץ גרעינים המכילים homologs שלם תלוי בשלושה גורמים עיקריים: 1) זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה במאגר היפוטוניק (דהיינו האם) כדי להשיג שלמאחה מתנפח spermatocyte הגרעינים פרץ, אך לא מתפוררות מ ממושך דגירה של מצגת, 2) micropipetting טיפות סוכרוז של ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...