Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00
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저자 애비 해리스의 기술 지원을 인정 한다. 그들은 또한 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 프로토콜을 최적화 하는 데 도움에 대 한 폴라 코헨과 김 웨이 인정 합니다. 저자는 또한 중요 한 독서의 카 렌 쉰들러에 의해 원고를 주셔서 감사합니다.
이 작품은 NIH R01 GM106262 K.M.B.에 의해 지원 되었다

쥐를 포함 하는 모든 방법을 활용 높은 윤리 및 복지 표준, 그리고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Drexel 대학 대학의과 대학에 의해 승인 했다.
1입니다. 솔루션 및 필요한 악기의 준비
<ol><li>초순 실험실 급료 물, pH 8.2-8.4 (표 1) 50 mL에 소형 추출 버퍼 (히)를 준비 합니다. 신선한 때마다, 얼음, 유지 하 고 확산; 준비의 2 시간 이내 사용 솔루션 이것은 줄이고 각각 DTT와 PMSF의 활?...

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

잘 확산, 좋은 품질 spermatocyte 핵의 높은 번호를 얻을,이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 히, 적절 한 seminiferous tubules의 닦지 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간을 포함 하 고 기술을 고용 통 코팅된 슬라이드에 자당 세포 현 탁 액 분산. 우리는 testes comparably 세 Chtf18에서 45 분, HEB에서 성인 기에 출생 후 하루 15에서에서 배열 하는 야생 타입 남성의 고환에서 seminiferous tubules를 품 어-null 생쥐...

마우스는 포유류에서 감수 분열을 연구 모델 생물으로 광범위 하 게 사용 됩니다. 정상적인 발달 과정 및 감수 분열 중 발생 하는 결함을 평가할 수 있습니다. 타임 라인 및 의향 어 substages, 하는 동안 발생 하는 돌출 하는 특징의 진행으로 다양 한 특정 단백질 감수 분열의 규칙에 중요 한 프로세스에 관련 된 야생 유형 및 돌연변이 생쥐에서 특징 수 있습니다. 내가 (헨델과 Schimenti1검토) 세부에서 공부 될 수 있다 감수 분열 중 발생 하는 몇 가지 특수 프로세스. DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 형성 및 수리, 재결합, synaptonemal 복잡 한 형성 및 염색체 분리 포함 됩니다.
Meiotic 프로세스의 중요 한 측면은 핵 시각과 광학 해결 되어 더 나은 포함 동종 염색체 구별 하 고 식별 의향 5 substages는 이루어져 I. 의향의 substages를 검사 하는 능력 그 synaptonemal 복잡 한 (SC)의 형성을 포함 하 여 특정 기능에 의해 특징. 사우스 캐롤라이나는 페어링 있도록 자간 단백질 비 계 및 homologs의 DNA 이중 가닥 브레이크 수리. Leptonema, 동안 homologs는 SC의 축 요소 답니다로 맞춥니다. 다음 zygonema 중 synaptonemal 복잡 한 중앙 요소 첨부 파일 homologs의 쌍 사이 연결 및 물리적 연결을 (synapsis)을 촉진 한다. Pachynema, 동안 homologs의 synapsis 완료 되 고 DNA 크로스 동종 재결합을 통해 DNA 두 배 물가 틈의 선택 인구의 수리에서 형성 된다. 사우스 캐롤라이나 동안에 diplonema, homologs desynapse 하지만 그들의 centromeres, DNA 크로스의 사이트에 연결 된 남아 있도록 디스어셈블 합니다. 마지막으로 동안에 diakinesis, homologs recondense 그리고 분열에 전환1.
역사적으로, 특히 그 의향의 초기 단계에서 몇 가지 핵 나왔고 meiotic chromatin의 표면 확산 나2. 결과적으로, 이러한 방법은 조직 즉 고환 (난소)에서 세포의 분리, 확산 meiotic chromatin의 기술과 높은 품질 meiotic 핵 평가2,3, 의 수확량을 개선 하기 위해 수정 된 4. 또한,이 방법은 핵 보존에 유용 하 게 입증 하 고 chromatin meiotic 핵에서 단백질 바인딩 같이 게시 된 immunolocalization 기법5,,67. 메서드를 처음 피터 스2 로 설명 하 고 시연 여기 수익률 겪고 의향의 leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, 및 diakinesis substages homologs를 포함 하는 많은 별도 버스트 spermatocyte 핵 따라서, 내가.
표면 확산 핵 (chromatin 확산 분석이 라고도 함)을 준비 하는 기술은 감수 분열 생식과 세포 생물학의 분야에서 연구에 널리 사용 됩니다. 표면 확산 핵 포함 된 슬라이드 수 이후에 관심사의 단백질에 항 체와 immunostained 또는 실버 얼룩, 대상이 되며 다음 현미경으로 분석. 메서드는 수정 여성 쥐2에 대 한 설명 되었습니다 비록 둘 다 남성과 여성 쥐에 대 한 유사. 그것은 overmince seminiferous tubules를 하지 중요 합니다. 핵 해야 합니다 또한 잘 확산 될 immunostaining homologs 다음 있도록 하 고 관련된 단백질 현미경으로 명확 하 게 볼 수 있습니다. 표면 확산 핵 불과 몇 시간에 어느 immunostained 즉시 준비 하거나 3 주 전에 해빙 및 immunostaining의 최대-80 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 그러나, 어떤 단백질에 대 한 최적의 결과 가져옵니다 가장 immunostaining 즉시 또는 표면 확산 핵 준비 2 주 이내에 수행 되는 경우. 슬라이드, 관심사의 단백질에 항 체를 사용 하 여 표준 프로토콜 immunostained 수 뒤에 2 차 항 체에 형광 활용된 단백질 또는 염료, 부 화 후 형광 현미경8군데. 출생 후 하루 15-21에서 6-10 슬라이드를 야생 타입 testes의 쌍 당 충분 한 조직 그리고 더 오래 된 쥐 (성인 포함) 더 많은 슬라이드를 얻을 것입니다. 그러나, 강포한 유형 쥐 6 주 동안 얻을 것입니다 또한 immunostaining 다음 슬라이드에 더 포스트 meiotic 세포 (예: spermatids). 또한, 의향의 모든 substages 내가 관찰할 수 있습니다 청소년과 성인 쥐에서. 출생 후 일 15 10 남성에서 고환 많은 leptotene 및 zygotene 셀을 얻을 것입니다. 쥐 출생 후 하루 14 ~ 15 보다 오래 된 pachytene 및 diplotene 핵을 더 얻을 것입니다.
여기 우리가 설명 하 고 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵 준비의 널리 사용 방법을 보여 줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

포유류의 감수 분열은 생식 세포에서 발생 하 고 공부 하 고 수 있는 특징 동적 개발 프로세스입니다. 메서드를 사용 하 여 슬라이드의 표면에 핵 확산 (보다는 오히려 그들에서 떨어지는 높이), 마우스 spermatocytes에 1997 년에 처음으로 설명 했다는 최적화 된 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 널리 이용 되는 고품질 핵 겪고 I. Seminiferous 의향의 substages의 과다 생성 때문에 포유류 감수 분열을 공부 하는 실험실에서 tubules 먼저 spermatocytes를 소형 솔루션에 배치 됩니다. 다음 spermatocytes를 만드는 세포 현 탁 액, 자당 솔루션으로 출시 되 고 핵 정착 액 젖 유리 슬라이드에 전파 됩니다. Immunostaining, 다음 meiotic 프로세스에 밀접 한 단백질의 다양성 시험 될 수 있다. 예를 들어 synaptonemal 복잡 한, homologs의 염색체 축/코어를 함께 연결 하는 3 자간 구조의 단백질은 쉽게 구상 될 수 있다. Meiotic 재결합 단백질, 동종 재결합에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 수리에 관련 된, 또한 의향의 진행을 평가 하는 immunostained 수 나. 여기 우리가 설명 하 고 자세하게에서 설명 널리 spermatocytes 청소년 이나 성인 남성 생쥐에서의 포유류 감수 분열을 공부 하는 기술.

많은 수의 표면 그대로 homologs를 포함 하는 핵 확산을 제공 하는이 방법의 능력 세 가지 주요 요인에 따라 달라 집니다: 1) 소형 버퍼 (즉 히)를 적절 하 게에서 seminiferous tubules의 적절 한 보육 시간 부 어 spermatocyte 버스트에서 분해 하지 않는 핵 히, 2 부 화 연장) micropipetting 함께, clumped는 핵 3 분리 중단을 얻기 위해 셀의 자당 방울) 한 번에 한 방향으로 슬라이드 코팅 각 정?...

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Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

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Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

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