Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Forfatterne bekrefter teknisk assistanse av Abigail Harris. De erkjenner også Paula Cohen og Kim Holloway for å optimalisere protokollen med å utarbeide overflaten oppslag kjerner fra mus spermatocytes. Forfatterne også pris på kritisk lesning av manuskriptet av Karen Schindler.
Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM106262 til K.M.B.

Alle metoder som involverer mus utnyttet høy etisk og velferd standarder, og ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på Drexel University College of Medicine.
1. forberedelse av løsninger og nødvendig
<ol><li>Forberede hypotonisk utvinning Buffer (HEB) i 50 mL av ultrapure laboratorium klasse vann, pH 8.2-8.4 (tabell 1). Gjøre løsningen fersk hver gang, holde på is og bruke innen 2 timer å forberede oppslag; Dette er nødvendig å optimalisere redusere og proteas...

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

For å få høyt antall godt spredt, god kvalitet spermatocyte kjerner, de viktigste trinnene i denne protokollen inkludere passende inkubasjon tid av seminiferous tubules i HEB, passende hakking av seminiferous tubules, og teknikken ansatt å spredt sukrose celle suspensjon over etappe, den stabiliserende belagt lysbildene. Vi ruge seminiferous tubules fra prøvene av vill type menn fra postnatal dag 15 til voksen i HEB i 45 minutter, mens testiklene fra sammenlignbare alderen Chtf18-null mus er ruges i bare 30...

Mus brukes mye som en modell organisme for å studere meiose i pattedyr. Både normale utviklingsprosesser og feil som oppstår under meiose kan evalueres. Tidslinjen og progresjon viktigste funksjonene som oppstår under prophase jeg og substages, samt en rekke spesifikke proteiner involvert i prosesser avgjørende for regulering av meiose kan være preget både vill type og mutant mus. Flere spesialiserte prosesser som oppstår under meiose jeg kan bli studert i detalj (omtalt i Handel og Schimenti1). Disse inkluderer DNA dobbel-strand pause (DSB) dannelse og reparasjon, rekombinasjon, synaptonemal kompleks dannelse og kromosom raseskille.
Et viktig aspekt å studere meiotic prosesser er muligheten til å undersøke kjerner inneholder homologe kromosomer som visuelt og optisk løses bedre skille og identifisere substages av prophase I. Prophase jeg består av 5 substages Det er preget av bestemte funksjoner inkludert dannelsen av synaptonemal komplekset (SC). SC er en tredelt protein skafottet som gjør at sammenkoblingen og DNA dobbel-strand pause reparasjon av homologs. Under leptonema Juster homologs som aksial elementer av SC er fastsatt. Deretter forenkler vedlegg av sentrale elementer til synaptonemal komplekset under zygonema sammenkoblingen og fysisk tilkobling (Adept) mellom par av homologs. Under pachynema, Adept av homologs blir fullført og DNA overganger er dannet av reparasjon av DNA dobbel-strand bryter via homologe rekombinasjon Velg innbyggere. SC disassembles under diplonema, slik at homologs desynapse men være knyttet til deres centromeres og på steder av DNA overganger. Endelig under diakinesis, homologs recondense og overgangen til metaphase skjer1.
Historisk overflaten-spredning av meiotic chromatin gitt noen kjerner, spesielt de fra tidlige stadier av prophase jeg2. Som et resultat, ble disse metodene endret for å bedre separasjon av celler fra vev (dvs. testikkel eller eggstokk), teknikken av spre meiotic chromatin, og avkastningen av høykvalitets meiotic kjerner for evaluering2,3, 4. I tillegg denne metoden viste seg for å være nyttig i å bevare kjernefysiske og chromatin bundet proteiner i meiotic kjerner som demonstrert av publiserte immunolocalization teknikker5,6,7. Derfor metoden først beskrevet av Peters2 og demonstrert her gir mange separate burst spermatocyte kjerner som inneholder homologs gjennomgår de leptotene, zygotene, pachytene, diplotene og diakinesis substages av prophase jeg.
Teknikken med å utarbeide overflaten oppslag kjerner (også kalt chromatin spre analyse) er mye brukt til å studere meiose innen reproduktiv og cellebiologi. Lysbilder som inneholder overflaten oppslag kjerner kan senere immunostained med antistoffer proteiner av interesse eller utsatt for sølv flekker, og deretter analysert med mikroskopi. Metoden er lik for både mannlige og kvinnelige mus, men endringene har blitt beskrevet for kvinnelige mus2. Det er viktig ikke å overmince seminiferous tubules. Kjerner må også være godt spredt slik at følgende immunostai-homologs og tilhørende proteiner er tydelig med mikroskopi. Overflaten oppslag kjerner kan være forberedt i bare noen få timer og enten immunostained umiddelbart eller lagret ved-80 ° C i opptil 3 uker før tining og immunostai. Imidlertid er optimale resultater best oppnådd for noen proteiner hvis immunostaining utføres umiddelbart eller innen 2 uker med å utarbeide overflaten oppslag kjerner. Lysbilder kan være immunostained med en standardprotokoll bruker antistoffer proteiner av interesse, etterfulgt av inkubasjon med sekundær antistoffer konjugert til fluorescerende proteiner eller fargestoffer og fotografert med fluorescens mikroskopi8. På postnatal dag 15-21 er tilstrekkelig vev per par av vill type testiklene til 6-10 lysbilder, og eldre mus (inkludert voksne) vil gi flere lysbilder. Men vil wild type mus 6 uker og eldre også gi mer etter meiotic celler (dvs. spermatids) på lysbildene etter immunostaining. Dessuten, alle substages av prophase jeg kan observeres i juvenile og voksen mus. Testiklene fra menn postnatal dager 10 til 15 vil gi mange flere leptotene og zygotene celler. Mus eldre enn postnatal dag 14 til 15 vil gi mer pachytene og diplotene kjerner.
Her vi beskriver og viser en brukte metoden med å utarbeide overflaten oppslag kjerner fra mus spermatocytes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Pattedyr meiose er en dynamisk utviklingsprosess som oppstår i bakterie celler og kan studerte og preget. Bruker en metode for å spre kjerner på overflaten av lysbildene (i stedet for å slippe dem fra en høyde), viser vi en optimalisert teknikk på musen spermatocytes som ble først beskrevet i 1997. Denne metoden er mye brukt i laboratorier for å studere pattedyr meiose fordi det gir en overflod av høy kvalitet kjerner gjennomgår substages av prophase I. Seminiferous tubules plasseres først i en hypotonisk løsning på hovne spermatocytes. Deretter spermatocytes slippes en sucrose løsning for å lage en celle suspensjon og kjerner er spredt på bindemiddel-gjennomvåt glass lysbilder. Etter immunostaining, et mangfold av proteiner germane til meiotic prosesser kan undersøkes. For eksempel proteiner av synaptonemal komplekset, en tredelt struktur som kobler kromosom akser/kjernene av homologs sammen kan være lett å visualisere. Meiotic rekombinasjon proteiner, som er involvert i reparasjon av DNA dobbel-strand bryter av homologe rekombinasjon, kan også være immunostained å vurdere progresjon av prophase jeg. Her vi beskriver og viser i detalj en metode mye brukt til å studere pattedyr meiose i spermatocytes fra juvenile eller voksne mannlige mus.

Evne til denne metoden for å gi et stort antall overflaten spre kjerner som inneholder intakt homologs avhenger av tre hovedfaktorer: 1) riktig inkubasjon tid av seminiferous tubules i hypotonisk buffer (dvs. HEB) for å få tilstrekkelig svulmet spermatocyte kjerner som brast men ikke oppløsning fra langvarig inkubasjon i HEB, 2) micropipetting sukrose dråper av celler for å få en atskilt suspensjon av kjerner som ikke er klumpet seg sammen, og 3) vipping hver bindemiddel belagt lys...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Meiose er utviklingsprosessen som dannes gameter gjennom én enkelt runde med utryddelse og to påfølgende rundene kromosom raseskille. Pattedyr meiose kan undersøkes ved å benytte en teknikk for å forberede meiotic kromosom oppslag. Her viser vi en metode for å forberede overflaten oppslag kjerner fra mus spermatocytes.

Utarbeidelse av Meiotic kromosom seg fra musen Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon Mus Utledet fra Utførte pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromosom Forberedelse Fra dyrkede celler

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

En Rask Air-tørr slippe Chromosome Forberedelse Metode Passer for FISH i Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...