Name: preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Författarna erkänner tekniskt bistånd av Abigail Harris. De erkänner också Paula Cohen och Kim Holloway för att hjälpa till att optimera protokollet för att förbereda ytan-spread kärnor från mus spermatocyter. Författarna uppskattar också kritisk läsning av manuskriptet av Karen Schindler.
Detta arbete stöds av NIH R01 GM106262 till K.M.B.

Alla metoder som involverar möss utnyttjas hög etisk och djurskyddsnormer, och godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén vid Drexel University College of Medicine.
1. beredning av lösningar och instrument som behövs
<ol><li>Förbereda hypoton utvinning buffert (HEB) i 50 mL ultrarena laboratorium grade vatten, pH 8,2-8.4 (tabell 1). Gör lösningen färska varje gång, hålla på is, och Använd inom 2 h för att förbereda spreads; Detta är nödvändigt at...

<ol>
	<li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mammalian+meiosis:+regulation,+dynamics+and+impact+on+fertility.">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li><li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline.">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li><li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy.">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li><li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading.">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li><li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates.">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li><li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over.">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li><li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin.">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li><li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice.">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996 (2012).</li><li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes.">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li><li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+cohesins+in+mitosis,+meiosis,+and+human+health+and+disease.">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li><li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+in+gametogenesis.">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li><li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+elaboration:+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics.">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li><li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites.">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li><li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis.">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li><li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+premature+G2/M-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis.">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li></ol>

För att få kicken numrerar av väl spridda, bra kvalitet spermatocyte kärnor, inkludera de viktigaste stegen i detta protokoll lämplig inkubationstid av sädeskanalerna i HEB, lämpliga malning av sädeskanalerna, och tekniken används för att spritt den fixativ belagda diabild(er) sackaros cellsuspension. Vi Inkubera sädeskanalerna från testiklarna av vildtyp hanar alltifrån postnatal dag 15 till vuxen i HEB för 45 min, medan testiklarna från comparably år Chtf18-null möss inkuberas i endast 30 min ...

Möss används i stor utsträckning som modellorganism för att studera meios hos däggdjur. Både normala utvecklingsprocesser och defekter som uppstår under meios kan utvärderas. Tidslinjen och progression av framträdande dragen som inträffar under profas jag och substages, samt en mängd specifika proteiner inblandade i processer som är avgörande för reglering av meios kan karakteriseras i både vildtyp och muterade möss. Flera specialiserade processer som inträffar under meios jag kan studeras i detalj (ses i Händel och Schimenti1). Dessa inkluderar DNA dubbel-strand paus (DSB) bildandet och reparation, rekombination, synaptonemal komplex bildandet och kromosomsegregering.
En viktig aspekt av att studera meiotiska processer är förmågan att undersöka atomkärnor innehållande homologa kromosomer som löses visuellt och optiskt bättre särskilja och identifiera substages av profas I. profas jag består av 5 substages som kännetecknas av särskilda funktioner inklusive bildandet av komplexet synaptonemal (SC). SC är en tredelad protein byggnadsställning som möjliggör ihopkoppling och DNA dubbel-strand paus reparation av homologs. Under leptonema justera homologs som axiella delar av SC fastställs. Sedan underlättar fastsättning av centrala element till synaptonemal komplexet under zygonema hopkoppling och fysisk anslutning (mås) mellan par av homologs. Under pachynema, synapsis av homologs blir komplett och DNA delningsfilter bildas från reparation av DNA dubbel-strand raster via homolog rekombination Välj invånare. SC Disassemblerar under diplonema, så att homologs till desynapse men sitta kvar på sin centromerer och platser av DNA delningsfilter. Slutligen under diakinesis, homologs recondense och övergång till metafas sker1.
Historiskt, surface-fördelande av meiotiska kromatin gav några kärnor, särskilt de från början av profas jag2. Som ett resultat, modifierades dessa metoder för att förbättra avskiljningen av celler från vävnader (testiklar eller äggstockar), tekniken att sprida meiotiska kromatin och avkastningen av hög kvalitet meiotiska kärnor för utvärdering2,3, 4. Dessutom denna metod visat sig vara användbart i att bevara kärnkraft och kromatin bundna proteiner i meiotiska kärnor vilket framgår av publicerade immunolocalization tekniker5,6,7. Därför metoden initialt beskrevs av Peters2 och visat här skördar många separata brast spermatocyte atomkärnor som innehåller homologs som genomgår de leptotene, zygotene, pachytene, diplotene och diakinesis substages av profas jag.
Tekniken att förbereda ytan-spread atomkärnor (även kallad kromatin spridning analys) används ofta för att studera meios i fälten för reproduktiv och cellbiologi. Bilder som innehåller yta-spread atomkärnor kan vara därefter immunostained med antikroppar mot proteiner av intresse eller underkastas silverfärgning, och sedan analyseras med mikroskopi. Metoden är liknande för såväl kvinnliga som manliga möss, även om modifieringar har beskrivits för honmöss2. Det är viktigt att inte overmince seminifera tubuli. Atomkärnor måste också spridas väl så att efter immunfärgning homologs och associerade proteiner ses tydligt med mikroskopi. Yta-spread atomkärnor kan tillagas i bara några timmar och antingen immunostained omedelbart eller förvaras vid-80 ° C i högst 3 veckor innan upptining och immunfärgning. Optimalt resultat erhålls dock bäst för vissa proteiner om immunfärgning utförs omedelbart eller inom 2 veckor för att förbereda ytan-spread atomkärnor. Bilderna kan vara immunostained med ett standardprotokoll som använder antikroppar mot proteiner av intresse, följt av inkubation med sekundära antikroppar konjugerad till fluorescerande proteiner eller färgämnen, sedan avbildas med fluorescence mikroskopi8. Vid postnatal dag 15-21 finns det tillräcklig vävnad per par av vildtyp testiklarna att ge 6-10 bilder och äldre möss (även vuxna) kommer att ge fler bilder. Men vildtyp möss 6 veckor och äldre kommer också att ge mer efter meiotiska celler (dvs. spermatids) på bilderna efter immunfärgning. Dessutom alla substages av profas jag kan observeras hos juvenila och vuxna möss. Testiklarna från män på postnatal dagar 10 till 15 kommer att ge många fler leptotene och zygotene celler. Möss som är äldre än postnatal dag 14 och 15 kommer att ge mer pachytene och diplotene kärnor.
Här vi beskriva och visa en allmänt använd metod för att förbereda ytan-spread kärnor från mus spermatocyter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>1464510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde aqueous solution)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>RT 15710</td>
			<td>Dilute 16% solution into 4% working stocks with 1X PBS and freeze aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon printed 3 ring slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63418-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium uncharged frosted end glass slides</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>Clean slides in ethyl or isopropyl alcohol and allow to drip dry prior to use; label slides on frosted end with a permanent marker or pencil depending on subsequent use of slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors (sharp and blunt tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip surgical scissors (sharp tips)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight fine tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved medium tip forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>16100110</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td>Different brand of a similar type will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-SYCP3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97672</td>
			<td>Use at 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-centromere protein (derived from human CREST patient serum)</td>
			<td>Antibodies Incorporated</td>
			<td>15-234-0001</td>
			<td>Use at 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use Nunc square culture dishes 500 cm2/well with moistened paper towels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield microscope with epifluorescence</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Any standard model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jars</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>50 ml capacity; 40 mm (1.6 in.) diameter, holds 10 slides (back to back)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Several commercial brands</td>
			<td></td>
			<td>100 x 15 mm diameter, polystyrene sterile untreated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of meiotic chromosome spreads from mouse spermatocytes

Däggdjur meios är en dynamisk utvecklingsprocess som sker i könsceller och kan studeras och karakteriseras. Med en metod för att sprida kärnor på ytan av diabilder (snarare än att släppa dem från höjd), visar vi en optimerad teknik på mus spermatocyter som beskrevs första gången 1997. Denna metod används ofta i laboratorier för att studera däggdjur meios eftersom det ger en uppsjö av hög kvalitet atomkärnor som genomgår substages av profas I. seminifera tubuli placeras först i en hypoton lösning att svälla spermatocyter. Sedan spermatocyter släpps ut i en sackaroslösning skapa en cellsuspension, och kärnor sprids på fixativ-indränkt glasskivor. Efter immunfärgning, en mångfald av proteiner som är nära förbunden med meiotiska processer kan undersökas. Till exempel kan proteiner i synaptonemal komplexet, en tredelad struktur som ansluter kromosom axlar/kärnar ur av homologs tillsammans visualiseras enkelt. Meiotisk rekombination proteiner som är involverade i reparation av DNA dubbel-strand raster av homolog rekombination, kan också vara immunostained att utvärdera utvecklingen av profas jag. Här vi beskriva och Visa i detalj en teknik som ofta används för att studera däggdjur meios i spermatocyter från unga eller vuxna manliga möss.

Denna metod förmåga att tillhandahålla ett stort antal ytan sprida atomkärnor som innehåller intakt homologs beror på tre faktorer: 1) lämplig inkubationstid av sädeskanalerna i hypoton buffert (dvs HEB) att erhålla adekvat svällde spermatocyte atomkärnor som sprack men inte sönderfaller från långvarigt inkubation i HEB, 2) micropipetting sackaros droppar av celler för att erhålla en separerade suspension av kärnor som inte är klumpgranulat tillsammans, och 3) luta varje...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes at JoVE.com

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Meiosen är den utvecklingsprocess som könsceller bildas genom en enda omgång DNA-replikation och två på varandra följande rundorna av kromosomsegregering. Däggdjur meios kan undersökas genom att använda en teknik för att förbereda meiotisk kromosomanalys sprider. Här visar vi en metod för att förbereda ytan-spread kärnor från mus spermatocyter.

Beredning av meiotisk kromosomanalys sprids från mus spermatocyter

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Beredning av dissocierade Mouse kortikala Neuron kulturer

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Beredning av encelliga Suspensioner från musmjälte med gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Standardiserade Beredning av encelliga Suspensioner från mus lungvävnad med gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Beredning av Drosophila polytene Kromosom Squash för Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av möss härledda från inducerade pluripotenta stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Kromosom Förberedelser från odlade celler

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

En snabb Lufttorka släppa Kromosomberedning som lämpar sig för FISH i växter

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Meiotisk Spindle Bedömning i musoocyter av siRNA-medierad Ljuddämpning

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...