Name: detection and enrichment of rare antigen-specific b cells for analysis of phenotype and function
Uploaded: 2017-02-16T15:00:00
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This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).

1. Isolamento de PBMC humanas <ol><li> Colete de 30-50 ml de sangue, utilizando tubos de coleta de sangue heparinizado. NOTA: A quantidade de sangue usado depende da questão experimental particular e frequência no sangue de células B específicas para o antigénio de interesse. O sangue heparinizado podem ser processados ​​imediatamente ou agitadas suavemente durante a noite à temperatura ambiente, durante o processamento do dia seguinte. O atraso no processamento tem muito pouco efeito sobre a eficáci...

<ol>
	<li>de Wildt, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+analysis+and+production+of+monoclonal+antibody+fragments+originating+from+single+human+B+cells.">A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells.</a> J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).</li><li>Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fractionation+and+arrangement+on+fibers,+beads,+and+surfaces.">Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).</li><li>Haas, W., Schrader, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+specificity+contributes+to+the+outcome+of+diabetes+in+nonobese+diabetic+mice.">B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice.</a> J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).</li><li>Woda, M., Mathew, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+dengue+viruses+as+probes+to+identify+antigen-specific+memory+B+cells+by+multiparametric+flow+cytometry.">Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).</li><li>Nair, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+fluorescent+labeling+to+identify+memory+B+cells+specific+for+Neisseria+meningitidis+serogroup+B+vaccine+antigens+ex+vivo.">Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo.</a> Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).</li><li>Amanna, I. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+and+characterization+of+virus-specific+B+cells+by+multicolor+flow+cytometry.">Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry.</a> Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).</li><li>Malkiel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoints+for+Autoreactive+B+Cells+in+Peripheral+Blood+of+Lupus+Patients+Assessed+By+Flow+Cytometry.">Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry.</a> Arthritis Rheumatol. , (2016).</li><li>Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+B+cell+populations+mediate+early+and+late+memory+during+an+endogenous+immune+response.">Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response.</a> Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).</li><li>Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD20+positive+human+B+lymphocytes+separated+with+the+magnetic+cell+sorter+(MACS)+can+be+induced+to+proliferation+and+antibody+secretion+in+vitro.">CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.</a> Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).</li></ol>

Descrevemos aqui um novo método para realizar o isolamento e enriquecimento de células B de ligação ao antigénio a partir de sangue periférico humano. O método é facilmente aplicável a ratinhos e a outros tecidos, tais como o baço e nos nódulos linfáticos, e é compatível com a análise pós-enriquecimento de fenótipo e função (manuscrito em preparação) célula. O utilizador deve ter conhecimento de um número de variáveis ​​que podem afectar o sucesso deste procedimen...

Diluição limitante análise de frequência do precursor de células secretoras de anticorpos sugerem que as células B reactivas a um antigénio particular ocorre tipicamente a uma frequência de 0,05 a 0,005% no repertório normal, dependendo do estado de vacinação e tamanho / número de epítopos presentes no antigénio. A baixa frequência destas células tornou difícil para estudar alterações do seu estatuto durante o desenvolvimento de respostas imunitárias, tais como a seguir a vacinação ou a exposição a um antigénio estranho, ou durante o desenvolvimento da auto-imunidade. Anteriormente, os investigadores assumiram isolamento das células B de antigénio reactivo usando técnicas que vão desde a placas revestidas com antigénio ou adsorventes de coluna, para reajuste de glóbulos vermelhos revestidos com o antigénio, a célula de triagem 1, 2, 3, 4, 5, 6 fluorescência-activado. though estas técnicas têm tido êxito na identificação e isolamento de células de antigénio-reactivo B, os resultados variaram em termos de rendimento, pureza e escalabilidade. Recentemente, desenvolveram um novo método para detectar e enriquecer subpopulações de linfócitos B raros usando nanopartículas magnéticas. O método permite o enriquecimento com um rendimento relativamente elevado e pureza a partir de grandes populações de partida, e é compatível com a análise das respostas ao antigénio. Por enriquecimento de populações de células em suspensão, o método elimina restrições que estão associadas com a geometria de placas ou colunas revestidas com antigénio, e o rendimento limite. Finalmente, uma vez que as células enriquecidas permanecem associadas com o antigénio e um repórter fluorescente, que pode ser adicionalmente purificado por separação por FACS. Tal como aqui descrito, temos usado esta abordagem para o estudo de células B de sangue tétano toxóide-reactivo periféricos antes e após a imunização de seres humanos, assim como células B auto-antigénio de reactivo de pacientes com diversas autoidistúrbios mmune, incluindo diabetes do tipo 1, doença de Graves e doença de Hashimoto 7. O método funciona igualmente bem no ratinho e humano, e é compatível com a análise de células de antigénio-reactivo B a partir de uma variedade de tecidos (manuscrito em preparação). No seu formato básico, células mononucleares de sangue periférico são primeiro incubadas com o antigénio biotinilado, juntamente com anticorpos para antigénios de superfície celular necessárias para a análise fenotípica. Esta etapa de rotulagem é seguida pela lavagem e fixação, e adição de estreptavidina acoplada a medida de corante-vermelho fluorescente para a detecção das células de ligação biotinilado-antigénio (Figura 1). Estudos anteriores identificaram as células B específicas do antigénio de um modo semelhante, mas utilizando antigénios directamente conjugado com um fluorocromo 8, 9, 10, 11. Embora esta seja uma dignaabordagem, a utilização de antigénios biotinilados em conjugação com estreptavidina permite uma maior amplificação de sinal (por conseguinte, uma melhor diferenciação de células não-ligação e de ligação), em particular quando os antigénios são pequenos 12, 13, 14. Uma consideração adicional é a utilização de estreptavidina em vez de avidina desglicosilada devido estreptavidina é, diminuir a ligação não específica. Além disso, usamos corante vermelho-distante-fluorescente como fluorocromo, devido à sua fotoestabilidade, rendimento quântico (brilho), e seu pequeno tamanho (~ 1,3 kDa). Fluorocromos proteínas, como ficoeritrina (~ 250 kDa) e aloficocianina (~ 105 kD) 15 não são ideais porque eles potencialmente conter muitos epítopos antigênicos. A utilização de um pequeno composto orgânico corante fluorescente de um único epítopo, tal como corante vermelho-distante-fluorescente, reduz a complexidade da população de células isoladas. Uma vez que as células são biotinilados-Antigen e adsorvido dye-estreptavidina far-vermelho-fluorescente, eles são enriquecidos usando nanopartículas magnéticas corante conjugado anti-far-vermelho-fluorescente. Nanopartículas individuais não são detectados pela maior parte dos citómetros de fluxo e, portanto, não necessitam de ser removidos antes da purificação por separação por FACS e ensaios a jusante 16. selecção magnética para células B específicas do antigénio enriquece a população de interesse, eliminando o tempo e custo da triagem eventos raros usando um citómetro de fluxo. Abaixo, mostramos resultados representativos de enriquecimento de células tétano-específicas do toxóide B de um assunto antes e sete dias após a imunização com toxóide tetânico reforço. Nós escolhemos esta aplicação particular como um exemplo para demonstrar a capacidade do presente método para o enriquecimento de células B específicas de antigénio seguintes aguda na estimulação in vivo. Quando acoplada com citometria de fluxo, este método é capaz de enriquecer e diferenciação específica de antigénio naïve, memória, ecélulas plasmablast B e permite ao pesquisador acompanhar as mudanças em sua freqüência ao longo do tempo. Além disso, incluir um outro ensaio a jusante possível, por exemplo, um ensaio ELISPOT, o que demonstra que as células conservam a capacidade de segregar anticorpos após o enriquecimento. Outra aplicação do presente método pode envolver a transferência adoptiva de células enriquecidas em um hospedeiro. Nós mostramos anteriormente células de manter a capacidade para actuar como antigénios das células para as células T específicas de antigénio seguintes isolamento e transferência apresentando (dados não mostrados). Assim, há uma série de ensaios a jusante possíveis que podem ser acopladas com o método, que em conjunto informa a compreensão da resposta imunitária específica do antigénio. Nós descrevemos o método abaixo, incluindo controles para determinar o rendimento global, pureza, especificidade celular, e dobre-enriquecimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="594">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="height:99px;width:164px;">Antigen of interest</td>
			<td style="width:104px;">variable</td>
			<td style="width:131px;">variable</td>
			<td style="width:196px;">At least 100 &#956;g to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier&#160; protein free.</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="118" style="height:118px;width:164px;">Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:104px;">e.g. Thermo Scientific</td>
			<td style="width:131px;">e.g. 21335</td>
			<td style="width:196px;">Biotin is available in different formulations, such as those containing&#160; various length spacers, so the type used should be determined by the researcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Streptavidin-Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:104px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">S21374</td>
			<td style="width:196px;">Can obtain from other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:164px;">Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">130-091-395</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:164px;">LS Columns</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">130-042-401</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:164px;">MACS manual separators</td>
			<td style="width:104px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:131px;">variable</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:164px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;">Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:164px;">PBS without calcium and magnesium</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:164px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:104px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">17-1440-02</td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:164px;">Whole blood in heparinized collection tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="69">
			<td height="69" style="height:69px;width:164px;">FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:164px;">Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA)</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:164px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:164px;">15 mL conical tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:164px;">1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="96">
			<td height="96" style="height:96px;width:164px;">Surface marker&#160; reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:164px;">ELISPOT supplies, if needed</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:196px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection and enrichment of rare antigen-specific b cells for analysis of phenotype and function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

Análise de pureza, rendimento, e dobre-o enriquecimento usando citometria de fluxo Populações enriquecidas como descrito acima, inevitavelmente conter células contaminantes que não se ligaram corante estreptavidina far-vermelho-fluorescente, mas estão presos na matriz. Estas impurezas podem ser removidas a partir de populações enriquecidas por separação FACS. Para estimar a pureza das populações enriquecidas, portão ...

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Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Research

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