Name: two algorithms for high-throughput and multi-parametric quantification of drosophila neuromuscular junction morphology
Uploaded: 2017-05-03T12:30:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology at JoVE.com

אנו מכירים את מרכז המשאבים דרוזופילה וינה ובלומינגטון דרוזופילה מרכז המניות (NIH P40OD018537) למתן זני דרוזופילה. אנו מודים ג&#39;ק פרנסן ממרכז הדמיה Microscopical לקבל תמיכה מקצועית בתחום ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי vidi ומענקים TOP (917-96-346, 912-12-109) מההסתדרות הולנד למחקר מדעי (NWO), על ידי שתי מלגות PhD DCN / Radboud המרכז הרפואי האוניברסיטאי, על ידי רשת פיגור שכלי גרמנית במימון התכנית + NGFN של משרד חינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF) ועל ידי Gencodys הרשת המשולב המידה הגדולה FP7 של האיחוד האירופי (בריאותי 241,995) כדי AS. הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או הכנת כתב היד.

<ol>
	<li>Lin, Y. C., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+synapse+and+dendrite+maintenance+and+their+disruption+in+psychiatric+and+neurodegenerative+disorders.">Mechanisms of synapse and dendrite maintenance and their disruption in psychiatric and neurodegenerative disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 349-378 (2010).</li><li>van Bokhoven, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+epigenetic+networks+in+intellectual+disabilities.">Genetic and epigenetic networks in intellectual disabilities.</a> Annu Rev Genet. 45, 81-104 (2011).</li><li>Penzes, P., Buonanno, A., Passafaro, M., Sala, C., Sweet, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+vulnerability+of+synapses+and+circuits+associated+with+neuropsychiatric+disorders.">Developmental vulnerability of synapses and circuits associated with neuropsychiatric disorders.</a> J Neurochem. 126, 165-182 (2013).</li><li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+dendritic+structure+on+firing+pattern+in+model+neocortical+neurons.">Influence of dendritic structure on firing pattern in model neocortical neurons.</a> Nature. 382, 363-366 (1996).</li><li>Yuste, R., Majewska, A., Holthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+form+to+function:+calcium+compartmentalization+in+dendritic+spines.">From form to function: calcium compartmentalization in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 3, 653-659 (2000).</li><li>Vetter, P., Roth, A., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+action+potentials+in+dendrites+depends+on+dendritic+morphology.">Propagation of action potentials in dendrites depends on dendritic morphology.</a> J Neurophysiol. 85, 926-937 (2001).</li><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+dendritic+spines.">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22, 383-388 (2012).</li><li>Mehnert, K. I., Cantera, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+morphology+of+neurons+in+Drosophila.">Circadian rhythms in the morphology of neurons in Drosophila.</a> Cell Tissue Res. 344, 381-389 (2011).</li><li>Sigrist, S. J., Reiff, D. F., Thiel, P. R., Steinert, J. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Experience-dependent strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J Neurosci. 23, 6546-6556 (2003).</li><li>Ruiz-Canada, C., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+on+the+use+of+the+Drosophila+embryonic/larval+neuromuscular+junction+as+a+model+system+to+study+synapse+development+and+function,+and+a+brief+summary+of+pathfinding+and+target+recognition.">Introduction on the use of the Drosophila embryonic/larval neuromuscular junction as a model system to study synapse development and function, and a brief summary of pathfinding and target recognition.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 1-31 (2006).</li><li>Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+plasticity+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction.">Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 647-670 (2013).</li><li>Kraut, R., Menon, K., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gain-of-function+screen+for+genes+controlling+motor+axon+guidance+and+synaptogenesis+in+Drosophila.">A gain-of-function screen for genes controlling motor axon guidance and synaptogenesis in Drosophila.</a> Curr Biol. 11, 417-430 (2001).</li><li>Parnas, D., Haghighi, A. P., Fetter, R. D., Kim, S. W., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+postsynaptic+structure+and+protein+localization+by+the+Rho-type+guanine+nucleotide+exchange+factor+dPix.">Regulation of postsynaptic structure and protein localization by the Rho-type guanine nucleotide exchange factor dPix.</a> Neuron. 32, 415-424 (2001).</li><li>Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynactin+is+necessary+for+synapse+stabilization.">Dynactin is necessary for synapse stabilization.</a> Neuron. 34, 729-741 (2002).</li><li>Laviolette, M. J., Nunes, P., Peyre, J. B., Aigaki, T., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+suppressors+of+Drosophila+NSF2+neuromuscular+junction+overgrowth.">A genetic screen for suppressors of Drosophila NSF2 neuromuscular junction overgrowth.</a> Genetics. 170, 779-792 (2005).</li><li>Collins, C. A., Wairkar, Y. P., Johnson, S. L., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+restrains+synaptic+growth+by+attenuating+a+MAP+kinase+signal.">Highwire restrains synaptic growth by attenuating a MAP kinase signal.</a> Neuron. 51, 57-69 (2006).</li><li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Fiji-Based+Algorithm+That+Systematically+Quantifies+Nine+Synaptic+Parameters+Provides+Insights+into+Drosophila+NMJ+Morphometry.">A New Fiji-Based Algorithm That Systematically Quantifies Nine Synaptic Parameters Provides Insights into Drosophila NMJ Morphometry.</a> PLoS Comput Biol. 12, e1004823 (2016).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Dubos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+depletion+of+intellectual+disability+and+Parkinsonism+candidate+gene+ATP6AP2+in+fly+and+mouse+induces+cognitive+impairment+and+neurodegeneration.">Conditional depletion of intellectual disability and Parkinsonism candidate gene ATP6AP2 in fly and mouse induces cognitive impairment and neurodegeneration.</a> Hum Mol Genet. 24, 6736-6755 (2015).</li><li>Nijhof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila NMJ Morphometrics. , (2017).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide IJ 1.46. , (2014).</li><li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ User Guide IJ 1.46. , (2014).</li><li>Pielage, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+presynaptic+giant+ankyrin+stabilizes+the+NMJ+through+regulation+of+presynaptic+microtubules+and+transsynaptic+cell+adhesion.">A presynaptic giant ankyrin stabilizes the NMJ through regulation of presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion.</a> Neuron. 58, 195-209 (2008).</li><li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ankyrin+2+is+required+for+synaptic+stability.">Drosophila ankyrin 2 is required for synaptic stability.</a> Neuron. 58, 210-222 (2008).</li><li>Iqbal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homozygous+and+heterozygous+disruptions+of+ANK3:+at+the+crossroads+of+neurodevelopmental+and+psychiatric+disorders.">Homozygous and heterozygous disruptions of ANK3: at the crossroads of neurodevelopmental and psychiatric disorders.</a> Hum Mol Genet. 22, 1960-1970 (2013).</li><li>Prokop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+efferent+system+and+structure+of+neuromuscular+junctions+in+Drosophila.">Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila.</a> Int Rev Neurobiol. 75, 71-90 (2006).</li><li>Wan, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highwire+regulates+synaptic+growth+in+Drosophila.">Highwire regulates synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 26, 313-329 (2000).</li><li>Shi, L., Fu, A. K., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+underlying+maturation+and+maintenance+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Molecular mechanisms underlying maturation and maintenance of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Trends Neurosci. 35, 441-453 (2012).</li><li>Sutcliffe, B., Forero, M. G., Zhu, B., Robinson, I. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-type+specific+functions+of+DNT1,+DNT2+and+Spz+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">Neuron-type specific functions of DNT1, DNT2 and Spz at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PLoS One. 8, e75902 (2013).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100 (2006).</li></ol>

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

&quot;דרוזופילה NMJ Morphometrics&quot; ו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot; הם כלים רבי עוצמה עבור חוקרים מעוניינים בהערכה מורפולוגיה סינפסה. הערכה ידנית של פרמטרי NMJ היא מייגע; ההערכה היא כי פקודות מאקרו יצילו חוקר מנוסה עד 15 דקות / NMJ בילה על פילוח תמונה ידני. עם אחד עד שני עשרות סינפסות העריכו לכל תנאי או גנוטיפ, זה מהר מסכם לסכומים ניכרים של זמן נשמר, גם מחקרים בקנה מידה קטנים. בעת ביצוע מסכים גדולים, רווח השימוש באבחון תפוקה גבוהה, לעומת הערכה ידנית וכימות, יכול להיות עצום. בנוסף תפוקה מוגברת, פקודות מאקרו לספק ניתוח אובייקטיבי בקלות; הם פוסלים הטיות אישיות אחרים דורשות ניסויים עיוורים כמו גם הבדלים בין-אישיים המתרחשים כאשר חוקרים שונים מעורבים בניתוח. לבסוף, פקודות מאקרו לספק רגיש ומדויקalysis של תכונות NMJ, המאפשר זיהוי של רגולטורים הסינפטי שגורמים די מתוחכם ממה פגמי NMJ דרמטיים עד כה נותרו מערירים העין של החוקר. מידע מפורט על הליכי אימות האלגוריתמים מנוצלים מאקרו נמצא al הפרסום Nijhof et. 17. הפונקציונליות של פקודות מאקרו אומת למדוד תכונות מורפולוגיות כראוי של תסיסנית NMJs על שריר 4. לאחר מכן, הודגם כי פקודות מאקרו היו גם מתאים לנתח סינפסות השרירים האחרים אורגניזם זה. סביר להניח כי פקודות מאקרו יכול לשמש גם כדי למדוד פרמטרים מורפולוגיים של NMJ עם מבנה דומה מינים אחרים, כולל מינים תסיסנית אחרים וחרקים נוספים. גם NMJs מאוד רחוק באבולוציה, למשל, NMJs של עכברים, להראות קונפורמציה מבנית דומה למדי 29. המקרו לא נבדק על הכנות NMJ ממינים אחרים אך משתמשים פוטנציאליים מוזמנים לבדוק את הפקודות מאקרו למטרות כאלה. זה מאוד חשוב שהמשתמש בוחן את auto-הספים ואלגוריתמים השונים להגדרה / לבחור את גדרות המאקרו המתאימות ביותר עבור התמונות. עם ההגדרות האלה, ברמת דיוק של כ 95% מושגת כאשר הערכת מאקרו הושוותה הערכה ידנית. התאמת הגדרות מאקרו קטע שצריך 100% של תמונות יכול להיות תהליך מאוד מייגע או אפילו בלתי אפשרי. לכן, הדרה של תמונות לא מפולחות כראוי מומלצת אם המספרים שלהם מתחת 5%. ברור, אם האיכות של התמונות היא נמוכה, פקודות מאקרו יפיק יחס גבוה יותר של סגמנטציה מספקות. תמונות באיכות נמוכה תשפיע הערכה ידנית דומה ולכן לא ניתן לקשר את הביצועים של פקודות מאקרו. אף על פי כן מאקרו הם חזקים למדי כפי שהם תוכננו עבור התמונהs שנוצר על מיקרוסקופ התכול גבוה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי המאפשר הדמיה של מספר הגדול של דגימות) 17. נקודה קריטית היא שהמשתמש חזותי בודק את כל תמונות התוצאה שנוצרו על ידי הפקודות מאקרו. זה יאפשר לזהות לכלול תמונות עם פילוח מאכזב. בסעיף 6 של פרוטוקול זה, המשתמש מודרך כיצד להתאים את ההגדרות עבור פילוח תמונה נכונה בעת הפעלת מאקרו תת &quot;לנתח&quot;. כדי להכיר את דרישות במהירות של המקרו כיצד להתאים את הגדרות מאקרו תיקייה בשם &quot;Examples_adjusting הגדרות המאקרו&quot; נכלל https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a מאגר מאקרו. שלוש עשר תיקיות משנה, כל אחד עם דוגמאות תמונות המתקבלות על פלטפורמות מיקרוסקופ שונות (תכולה גבוהה / confocal / מיקרוסקופי פלואורסצנטי) ו immunostainings השונה, ניתנות. קובץ PDF תחת כותרת &quot;מדריך דוגמאות&quot; נכלל באותהתיקייה שבה ההגדרות הדרושות עבור כל דוגמא ניתנות, יחד עם מסמך טקסט מתן תמונות תוצאות ואת התוצאות הצפויות. המקרו תוכננו לעבד תמונות שנשמרו כמו .tiff מופרד קבצים, בכל זאת חלק מהמשתמשים עשויים להציל את התמונות שלהם במתכונת שונה. Https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a האינטרנט הבא 21 מכיל תיקייה בשם &quot;NMJ תסיסנית&quot; שבו שלושה קבצים לדוגמה (דוגמה 1 - 3) ומסמך &quot;מדריך דוגמאות&quot; עם הוראות מפורטות כיצד לייבא תמונות לתוך מאקרו אם לא מאוחסן כמו .tiff קבצים מופרדים ניתן למצוא גם באותה תיקייה. יחד, &quot;דרוזופילה NMJ Morphometrics&quot; ו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot; פקודות מאקרו לכמת עשר תכונות NMJ שונים: אזור NMJ, ההיקף NMJ, מספר boutons, NMJ בוטון באזור, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איסלהNDS, מספר הסניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר האזורים פעילים. זה מספק יתרון גדול על פני כלים עד כה זמינים שיכול להעריך רק אחד או כמה תכונות הסינפטי 30, 31. ניתוח כמוני Multiparametric נושא פוטנציאל גדול עבור תגליות חדשות, למשל, לזהות רגולטורי רומן ששולטים אחד עד היבטים רבים של ביולוגית סינפסה. הוא גם מספק את הרזולוציה הנדרשת כדי לקבוע גני coregulate בדיוק תכונות NMJ הזהות או חופפים ולכן צפויים לפעול מסלולים מולקולריים משותפים. לבסוף, הוא פותח את האפשרות לחקור כיצד פרמטרים הסינפטי לתאם אחד עם השני בתנאים באין מפריעים 17 ואשר הודות לגנים מתאמים מורפומטריות מתואמים כזו. יחדיו, פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בשתי פקודות מאקרו &quot;Morphometrics NMJ תסיסנית&quot; ו&quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot;, אשר לבצע כימות אובייקטיבי ורגיש של עשר תכונות מורפולוגיות NMJ באופן תפוקה גבוהה.

הפרעות קוגניטיביות כגון נכות אינטלקטואלית, הפרעת ספקטרום האוטיזם וסכיזופרניה מאופיינות לעתים קרובות פונקצית 1 הסינפטי נורמלי, 2, 3. מורפולוגיה פונקצית סינפסה היא בחוזקה סבוכים זה בזה: פגמים מורפולוגיים יכולים לגרום לתקלה הסינפטי, reversely, העברה סינפטית סוטה תשפיע התבגרות הסינפטי ומורפולוגיה 4, 5, 6. מספר אורגניזמים מודל הועסק על מנת להבין טוב יותר את הביולוגיה הסינפסה לשפוך אור על כמה שינויים סינפטיים להשפיע תפקוד המוח בריאות ומחלות 7, 8, 9. NMJ תסיסנית הוא למד בהרחבה ומבוססת במודל vivo עבור glutamatergic סאיםnapse ביולוגיה 10, 11. בעשורים האחרונים, מודל זה שימש במשך מחקרים פיזיולוגיים הגן ממוקד, כמו גם עבור מסכי גנטית בקנה מידה גדול, במטרה לזהות הבדלים מורפולוגיים בין NMJs. בפרט, מסך גנטי קדימה זיהה רבי רגולטורי מנגנונים חיוניים שבבסיס התפתחות הסינפסה לתפקד 12, 13, 14, 15, 16. עם זאת, רוב המסכים הללו הסתמכו על הערכה חזותית של מורפולוגיה מסוף NMJ ועל גילוי איכותני של הפרעות הסינפטי או הבקיע חצי כמותית של כמה תכונות מורפולוגיות. כתוצאה מכך, דווקא עדין הפרעות מורפולוגיים הסינפטי שאינם ברורים לעין האנושית הם החמיצו בקלות. על מנת להיות מסוגל לזהות הבדלים כמותיים באופן מקיף, אתיש NMJ להיבדק במדויק על ידי כימות שיטתי של פרמטרים מורפולוגיים של עניין. מדידת תכונות NMJ ידנית מייגעת, במיוחד כאשר ישנם מספר תכונות NMJ של ריבית ו / או בעת ביצוע הקרנות גנטיות בקנה מידה גדולה. על מנת לתמוך multiparametric, ניתוח מורפולוגי תפוקה גבוהה וכדי להשיג כימות אובייקטיבי, שתי פקודות מאקרו &quot;Morphometrics תסיסנית NMJ&quot; ו &quot;Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון&quot; פותחו 17. מאקרו שניהם לרוץ תוכנה לניתוח תמונה קוד פתוח פיג&#39;י 18, והוא יכול לכמת את שתי התמונות confocal ו nonconfocal. אמצעים &quot;דרוזופילה NMJ Morphometrics&quot; מסופי NMJ immunostained עם דיסק סמן postsynaptic גדול 1 (DLG-1) או peroxidase חזרת presynaptic (HRP), שיתוף שכותרתו עם bruchpilot סמן אזור פעיל (BRP). זה מכמת תשעה parame מורפולוגייםters (המתוארת בהמשך): אזור NMJ, ההיקף NMJ, מספר boutons, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איים, מספר סניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר אזורי פעיל המסוף הסינפטי (איור 1) . למרות אלגוריתם לקביעת מספר boutons שוהה המאקרו הזה, זה לא עומד בקריטריונים של דיוק 17. כדי להעריך את המספר כראוי של boutons, יש צורך להשתמש במאקרו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot;, אשר תוכנן במיוחד כדי לכמת boutons באמצעות הכנות NMJ immunostained ידי אנטי-Synaptotagmin (Syt) או חלבון מחרוזת אנטי-ציסטאין (CSP), ושיתוף immunolabeled עם BRP. המאקרו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot; מכמת את הפרמטרים הבאים: מספר boutons, אזור בוטון NMJ, אורך NMJ, אורך הסניף הארוך NMJ, מספר איים, מספר סניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר zo פעילנס (איור 2). המקרו מורכב 3 תת-מאקרו: (I) &quot;המר לערום&quot; מזהה את כל קבצי התמונה הזמינים ויוצר-hyperstacks Z ו- תחזיות בעצמה מקסימלית של שני הערוצים. כפלט, מאקרו זה יפיק שני קבצים חדשים בכל סינפסה שנקרא &quot;stack_image_name&quot; ו &quot;flatstack_image_name&quot;. II) &quot;גדר ROI&quot; יפתח את כל תמונות הקרנת מקסימלית &quot;flatstack_image_name&quot; ברציפות ולהציגם עם הבקשה ידנית להגדיר את האזור של עניין (ROI) שבה המסוף הסינפטי הספציפי של העניין קיים. זו יושמה כדי לאפשר הרחקה של סינפסות חיבור השרירים הסמוכים ו / או סוגים אחרים של מסופי הסינפטי (כגון 1s) שיכול להיות נוכח התמונות 11. (III) &quot;לנתח&quot; חל אוטומטי ניתוח מלא לכל האזורים של התמונות בתוך הגבולות של ROI. כפי שבעקבות צעד זה, המשתמש יקבל שני קבצים חדשים: &quot;results.txt&quot; שבו כל המדידה המספרית תהיה מבוארת ו &quot;res_image_name.tif&quot; שבו סגמנטציה הבסיסית המיוצרת על ידי מאקרו שתודגם. במהלך ניתוח תמונה שלושה מבנים נגזרים כל מסוף סינפטי: מתווית NMJ, שלד NMJ, ומספר BRP חיובי האזורים פעילים. מתווית NMJ משמשת כדי לקבוע את אזור NMJ וההיקף שלה פרדת פרשה מים עוקבת מספקת מספר boutons. מן השלד, חמש תכונות NMJ מוסקות: אורך NMJ הכולל, הסכום של אורך הנתיב הארוך הרציף חיבור כל שתי נקודות קצה (אורך סניף ארוך), מספר תאים שאינם קשורים לכל NMJ (המכונה &quot;אי&quot; ), מספר הסניפים, ואת מספר נקודות הסתעפות (בהתפצלות אחד מתחברת סניפים שלושה או יותר). מספר האזורים הפעילים נקבע על-ערוץ BRP ידי ספירהכתמי BRP חיוביים. מתווית NMJ המבוארת (הקו צהוב), שלד NMJ (הקו כחול), ומספר BRP חיובי האזורים פעילים (מסומן מוקדים לבנים) מוצגות תמונת תוצאות המדידות של הפרמטרים מעובדות ל (. txt) קובץ הפלט (איור 3). דרוזופילה NMJ Morphometrics&quot; ו &#39;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&#39; תוארו הראשון ומאומתים בהרחבה על ידי Nijhof et al. 17. כתב יד זה מתמקד המתודולוגיה לנתח מורפולוגיה NMJ באמצעות פקודות מאקרו &#39;Morphometrics NMJ תסיסנית&#39; ו &#39;Morphometrics תסיסנית NMJ בוטון&#39;. עם זאת, לפני ניתוחים מאקרו בסיוע, NMJ וניתוחים ו immunostainings צריכות להתבצע. אלה הם צעדים מכריעים, והשילוב של סמנים המשמש אימונוהיסטוכימיה צריך להיות מתאים ניתוחי מאקרו. צעדים אלה מוזכרים בקצרה section 1 של פרוטוקול זה לכוון את משתמש אזכור המתאר בפירוט את הפרוטוקולים לבצע הליכים אלה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-discs large 1</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>AFFN-DLG1-4D6</td>
			<td>1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-horseradish peroxidase</td>
			<td>Jackson IR</td>
			<td>323-005-021</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Synaptotagmin</td>
			<td>Gift from Hugo Bellen</td>
			<td></td>
			<td>Jan-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Cysteine string protein</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>DCSP-1(ab49)</td>
			<td>1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Bruchpilot</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>nc82</td>
			<td>Jan-50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11011</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Z25006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Confocal microscope or fluorescence microscope</td>
			<td>Leica SP5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio imager</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Mac or Pc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two algorithms for high-throughput and multi-parametric quantification of drosophila neuromuscular junction morphology

מורפולוגיה Synaptic היא בחוזקה הקשורים ליעילות סינפטית, ובמקרים רבים פגמי סינפסה מורפולוגיים בסופו של דבר להוביל לתקלה הסינפטי. צומת העצב-שריר הזחל תסיסנית (NMJ), מודל ומבוסס על סינפסות glutamatergic, נחקר בהרחבה במשך עשרות שנים. זיהוי של מוטציות גרימת פגמים מורפולוגיים NMJ חשף רפרטואר של גנים מווסתים פיתוח סינפסה ולתפקד. רבים מאלה שזוהו במחקרים רחב היקף אשר התמקדו גישות איכותיות כדי לזהות חריגויות מורפולוגי של תסיסנית NMJ. חסרון של ניתוחים איכותיים הוא ששחקנים עדינים רבים התורמים מורפולוגיה NMJ יבחינו סביר. בעוד ניתוחים כמותיים נדרשים לזהות את ההבדלים המורפולוגיים המעודנים, שניתוח כזה הוא עדיין לא בצע פקודות כי הם מייגעים. פרוטוקול זה מתאר באלגוריתמים לניתוח פרט לשני תמונה &quot;דרוזופילה </em&gt; NMJ Morphometrics&quot; ו &#39;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&#39;, זמין כמו פקודות מאקרו פיג&#39;י תואם, עבור ניתוח morphometric כמותית, מדויק ואובייקטיבי של דרוזופילה NMJ. מתודולוגיה זו פותחה כדי לנתח מסופי NMJ immunolabeled עם סמנים נפוצים DLG-1 ו . BRP בנוסף, היישום הרחב יותר שלה סמנים אחרים כגון Hrp, CSP ו Syt מוצג פרוטוקול זה המקרו מסוגל להעריך תשעה סרטים עלילתיים NMJ מורפולוגיים:. אזור NMJ, היקף NMJ, מספר boutons, אורך NMJ, סניף ארוך NMJ אורך, מספר האי, מספר הסניפים, מספר נקודות הסתעפות ומספר האזורים פעילים מסוף NMJ.

Watch this Scientific Journal Video about Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology at JoVE.com

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

שני אלגוריתמים לניתוח תמונה, &quot;Morphometrics תסיסנית NMJ&quot; ו &quot;דרוזופילה NMJ בוטון Morphometrics&quot; נוצרו, לכמת באופן אוטומטי תשע תכונות מורפולוגיות של צומת דרוזופילה שרירית (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

זיהוי של<em&gt; באתר</em&gt; מכלולי חלבון-חלבון ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

FIM Imaging and FIMtrack: Two New Tools Allowing High-throughput and Cost Effective Locomotion Analysis

FIM הדמיה וFIMtrack: שני כלים חדשים המאפשר תפוקה גבוהה וניתוח תנועה חסכוני

The analysis of neuronal network function requires a reliable measurement of behavioral traits. Since the behavior of freely moving animals is variable to ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

ניתוח תפוקה גבוהה של התנהגות גינקולוגיות וזמינותו האי דרוזופילה

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...