Name: evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Tsjechische ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport (LO1304) en de technologische Agentschap van de Tsjechische Republiek (TE01020028). De auteurs willen graag bedanken Dr. Lakshman Varanasi voor het nemen van de foto&#39;s van milieu-deksels.

1. Bereiding van agarose gecoate platen <ol><li> Weeg 0,75 g laag-smeltpunt agarose toevoegen aan 100 ml McCoy&#39;s 5A medium (met of zonder fenolrood) zonder serum. Verwarm de oplossing in een magnetron en schud elke 1-2 min de agarose volledig op te lossen. Autoclaaf de oplossing te steriliseren. </li><li> Koel het agarose autoclaaf tot ongeveer 70 ° C en filtreer het door een 500 mL, 0,22 urn filter top door vacuumfiltratie in een laminaire stroming in. Aliquot de 0,75% gefilterde agarose-oplossing (FAS) in klein...

<ol>
	<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+An+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening.">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer.">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).</li><li>Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+angiogenic+capability+is+regulated+by+3D+culture+and+integrin+engagement.">Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).</li><li>Lao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+to+Generate+Spheroid+Cultures+from+Tumor+Cells,+Tumor+Cells+&amp;+Fibroblasts+or+Tumor-Fragments:+Microenvironment,+Microvesicles+and+MiRNA.">Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells &amp; Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).</li><li>Wenzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-content+screening+for+the+identification+of+compounds+that+target+cells+in+dormant+tumor+spheroid+regions.">3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions.</a> Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis:+High-Throughput+Screening+Assay+Development,+Validation,+and+Pilot+Screen.">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li><li>Das, V., F&#252;rst, T., Gursk&#225;, S., D&#382;ub&#225;k, P., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates:+The+Effect+of+Medium+Evaporation.">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li><li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+imaging-based+platform+for+high-content,+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models.">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).</li><li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics.">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li><li>Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models.">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Cost+Efficient+Method+to+Avoid+Unequal+Evaporation+in+Cellular+Screening+Assays,+Which+Restores+Cellular+Metabolic+Activity.">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li><li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays.">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes.">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures.">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids:+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically.">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).</li></ol>

Coating 384-Well TC Platen met Filtered Agarose De gangbare praktijk in LOT is een 1-1,5% laag smeltpunt agarose gebruiken om de vacht van de platen, die de agarose en / of apotheekhoudend apparaat heeft verwarmd te worden gehouden aan de geleren van de agarose 6 te voorkomen. Het geleren van de agarose is potentieel problematische tijdens het bereiden van meerdere platen met vloeibare afgeven cassettes met slangetjes openingen variërend tussen 0,2 en 0,4 mm in diameter...

Kankercellen in tumoren fysiologisch gerangschikt in een complex, 3-dimensionale (3D) structuur omgeven door extracellulaire matrix en interagerende cellen. Daar bijna alle cellen in weefsels in een 3D-omgeving bevinden, is de behoefte aan meer fysiologisch relevante in vitro tumormodellen die tumor eigenschappen nabootsen geleid tot de ontwikkeling van verschillende 3D kweektechnieken 1, 2, 3. Deze modellen worden nu fundamenteel onderzoeksinstrumenten voor het bestuderen van de rol van de tumor micro op metastase en celrespons op therapeutica 3D 2. Bovendien, in vergelijking met 2-dimensionale (2D) celculturen 4, 3D apparaten kan een beter begrip van tumor-stroma interacties, welke cel signaalroutes beïnvloeden. Multicellulaire bolvormige tumoren (MCTSes) kankercellijnen worden vaak gebruikt in 3D cel cultuur modellen als gevolg van hun relatieve nabijheid van in vivo tumoren. Van de verschillende technieken gebruikt, is de vloeistof-overlaytechniek (LOT) MCT generatie on-agarose gecoate platen significant belang voor lead optimalisatie en targetvalidatie 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 bereikt. Dit blijkt uit de recente studies die met succes kunnen pilot-schermen van collecties van chemische moleculen draaien in MCTS culturen met behulp van LOT 6, 7 waren. Echter, well-to-well variabiliteit in MCTS morfologie en groei als gevolg van de verdamping veroorzaakte ongelijke verlies van het medium komen vaak hindernissen die de LOT met behulp van microtiterplaten (MPS) te begeleiden. Bijgevolg is de vorming van niet-uniforme MCTSes compromitteert de betekenis en relevantiegegevens van farmacologische assays 8, 12, 13. Naast de reproduceerbaarheid kwesties ander praktisch probleem dat LOT-based high-throughput assays beïnvloedt is de bekleding van de MPs met agarose bij automatische vloeibare toedieningseenheden. Hoewel de afgifte-eenheid verwarmd tot de gelering agarose voorkomen kan worden gehouden, het verstoppen van de afgifte cassette leidingen is een potentiële zorg voor robotsystemen 6. Om een aantal van deze uitdagingen te overwinnen, hebben we onlangs bedacht een paar wijzigingen in de LOT voor MCTS cultuur 8. Deze wijzigingen zijn voornamelijk gebaseerd op de mogelijkheden om ongelijke medium verlies van MPs gebruiken instrumenten die gewoonlijk worden aangetroffen in screeningslaboratoria high-throughput voorkomen. Een gedetailleerde procedure van de gewijzigde LOT voor het genereren van uniforme grootte en reproduceerbare MCTSes over 384-well platen (WP) wordt hier gepresenteerd. Het manuscript geeft een semi-automatische routine voor de evaluatie van MCTS grootte, met name in gedeeltelijk gedesintegreerde, geneesmiddelbehandelde MCTSes dat geen duidelijke begrenzing voor het meten van de doorsnede hebben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Low-melting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCOY&#39;s 5A Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;rapid&#8221; Filtermax filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99505</td>
			<td>0.22 &#956;m, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop&#8482; Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Tube Dispensing cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24073295</td>
			<td>Metal tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well TC plate&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057308</td>
			<td>Plate type- CellCarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tube Dispensing Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroClime Environmental Lid</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LLS-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Incubator (SteriStore )</td>
			<td>HighRes Biosolutions</td>
			<td>23641</td>
			<td>Serial No.: D00384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: EL406&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: CV7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Express recombinant cell dissociation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates

Tumormodellen die nauw nabootsen in vivo omstandigheden worden steeds populairder in geneesmiddelen en ontwikkeling voor de screening van potentiële geneesmiddelen tegen kanker. Meercellige bolvormige tumoren (MCTSes) effectief te bootsen de fysiologische omstandigheden van solide tumoren, waardoor ze uitstekend in vitro modellen voor lead optimalisatie en target validatie. Van de verschillende technieken beschikbaar voor het MCTS cultuur, de vloeistof-overlay methode op agarose is een van de meest goedkope werkwijzen voor MCTS genereren. Echter, de betrouwbare overdracht van MCTS culturen die vloeibare-overlay voor high-throughput screening worden beïnvloed door een aantal beperkingen, waaronder de bekleding van microtiterplaten (MPs) met agarose en irreproducibility uniforme MCTS formatie in putten. MPs significant gevoelig voor effecten die resulteren uit overmatige verdamping van medium vanaf de buitenzijde van de plaatrand, die het gebruik van de gehele dienblad drugproeven. Dit manuscript bevat gedetailleerde technische verbeteringen aan de vloeistof-overlay techniek om de schaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van uniforme MCTS vorming verhogen. Daarnaast, details op een eenvoudige, semi-automatische en universeel toepasbare software tool voor de evaluatie van MCTS beschikt na de behandeling met geneesmiddelen wordt gepresenteerd.

De ongelijke verlies van medium, in het bijzonder van de perifere putjes, is een veel voorkomende probleem in Kamerleden met kleine cultuur volumes. Substantieel verbeterde kweekomstandigheden, zoals incubatoren met goed gecontroleerde temperatuur / bevochtigingsystemen en verdamping verminderen MPs en plaat deksels, verminderen significant verlies drager in putjes 8. De relatieve verdamping te meten, gelijke volumes Orange G (OG) werden aan elk putje toegevoegd e...

Watch this Scientific Journal Video about Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates at JoVE.com

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

De ongelijke verlies drager van microtiterplaten beïnvloedt de reproduceerbaarheid van uniforme multicellulaire bolvormige tumoren ontstaan. Verbetering kweekomstandigheden aanzienlijk medium verlies zal de reproduceerbaarheid van sferoïde vorming en de resultaten van sferoïde-gebaseerde testen met de vloeistof-overlay techniek te verbeteren verminderen.

Verdamping-reducerende Cultuur Voorwaarde Verhoogt de reproduceerbaarheid van Meercellige Sferoïde Formation in microtiterplaten

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

Een algemene methode voor het opsporen van Nitrosamide-formatie in het metabolisme In Vitro van nitrosaminen door cytochroom P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Een 3D Organotypic melanoom sferoïde huidmodel

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiëring van antikanker antilichaam werkzaamheid door Antineoplastische Drugs: detectie van antilichaam-drug synergie met de combinatie Index vergelijking

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identificatie en karakterisering van het histologische dissectie van de prostaat lobben van de muis voor In Vitro 3D sferoïde cultuur modellen

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...