Name: evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère tchèque de l&#39;éducation, de la jeunesse et des sports (LO1304) et l&#39;Agence technologique de la République tchèque (TE01020028). Les auteurs tiennent à remercier le Dr Lakshman Varanasi pour prendre des images fixes de couvercles environnementaux.

1. Préparation des plaques d&#39;agarose revêtues <ol><li> Peser 0,75 g de bas point de fusion d&#39;agarose et l&#39;ajouter à 100 ml de milieu 5A de McCoy (avec ou sans rouge de phénol) sans sérum. Chauffer la solution dans un four micro-ondes et agiter toutes les 1-2 minutes pour dissoudre complètement l&#39;agarose. Autoclave la solution pour le stériliser. </li><li> Refroidir l&#39;autoclave d&#39;agarose à environ 70 ° C et filtrer à travers un 500 ml, 0,22 um filtre supérieur par filtration sous vide...

<ol>
	<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+An+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening.">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer.">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).</li><li>Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+angiogenic+capability+is+regulated+by+3D+culture+and+integrin+engagement.">Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).</li><li>Lao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+to+Generate+Spheroid+Cultures+from+Tumor+Cells,+Tumor+Cells+&amp;+Fibroblasts+or+Tumor-Fragments:+Microenvironment,+Microvesicles+and+MiRNA.">Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells &amp; Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).</li><li>Wenzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-content+screening+for+the+identification+of+compounds+that+target+cells+in+dormant+tumor+spheroid+regions.">3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions.</a> Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis:+High-Throughput+Screening+Assay+Development,+Validation,+and+Pilot+Screen.">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li><li>Das, V., F&#252;rst, T., Gursk&#225;, S., D&#382;ub&#225;k, P., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates:+The+Effect+of+Medium+Evaporation.">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li><li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+imaging-based+platform+for+high-content,+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models.">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).</li><li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics.">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li><li>Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models.">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Cost+Efficient+Method+to+Avoid+Unequal+Evaporation+in+Cellular+Screening+Assays,+Which+Restores+Cellular+Metabolic+Activity.">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li><li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays.">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes.">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures.">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids:+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically.">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).</li></ol>

Revêtement 384 puits TC Plaques avec Filtré Agarose La pratique standard dans LOT est d&#39;utiliser un bas point de fusion d&#39; agarose 1-1,5% pour enduire les plaques, ce qui nécessite l&#39;agarose et / ou unité de distribution à garder chauffée pour empêcher la gélification de l&#39;agarose 6. La gélification de l&#39;agarose est une préoccupation potentielle lors de la préparation de multiples plaques en utilisant des cassettes de distribution de liquid...

Les cellules cancéreuses dans les tumeurs sont disposées dans un plan physiologique, en 3 dimensions (3D) de structure complexe entouré par une matrice extracellulaire et les cellules qui interagissent. Que presque toutes les cellules dans les tissus se trouvent dans un environnement 3D, la nécessité d&#39; une plus physiologiquement pertinente dans des modèles de tumeur in vitro qui imitent les caractéristiques de la tumeur a entraîné le développement de plusieurs techniques de culture 3D 1, 2, 3. Ces modèles sont en train de devenir des outils de recherche fondamentale pour étudier le rôle du microenvironnement tumoral sur les métastases et la cellule de réponse à la thérapeutique en 3D 2. En outre, par rapport aux cultures (2D) , la cellule 2 dimensions 4, les modèles 3D permettent une meilleure compréhension des interactions tumeur-stroma, qui affectent les voies de signalisation cellulaires. sphéroïdes de tumeur multicellulaires (MCTSes) de lignées de cellules cancéreuses sont fréquemment utilisés dans les cellules 3D cmodèles en raison de leur proximité par rapport aux tumeurs in vivo de ulture. Parmi les nombreuses techniques utilisées, la technique de liquide de recouvrement (LOT) de génération SCTM sur des plaques d&#39;agarose revêtues a suscité un intérêt considérable pour l&#39; optimisation de plomb et une cible de validation 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Cela est évident à partir des études récentes qui ont été en mesure d&#39;exécuter avec succès des écrans pilotes de bibliothèques de composés dans les cultures SCTM utilisant LOT 6, 7. Cependant, la variabilité de SCTM morphologie et la croissance du puits à bien en raison de la perte inégale induite par évaporation du milieu sont des obstacles communs qui accompagnent le LOT en utilisant des plaques de microtitrage (MP). Par conséquent, la formation de non-uniforme MCTSes compromet l&#39;importance et la pertinencedes données provenant des essais pharmacologiques 8, 12, 13. En plus des problèmes de reproductibilité, un autre problème pratique qui affecte des essais à haut débit à base de LOT est le revêtement des députés avec agarose lors de l&#39;utilisation de liquide automatique des unités de distribution. Bien que l&#39;unité de distribution peut être maintenu chauffé afin d&#39; éviter la gélification de l&#39; agarose, l&#39;obstruction de la cassette et le tube de distribution est un problème potentiel pour les systèmes robotiques 6. Pour surmonter certains de ces défis, nous avons récemment mis au point quelques modifications dans le LOT pour MCTS culture 8. Ces modifications sont principalement basées sur les moyens possibles pour empêcher la perte moyenne inégale des députés au moyen d&#39;instruments qui se trouvent couramment dans les laboratoires de criblage à haut débit. Une procédure détaillée de la LOT modifiée pour la génération d&#39;MCTSes de taille uniforme et reproductible à travers 3plaques 84 puits (WPS) est présenté ici. Le manuscrit présente également une routine semi-automatique pour l&#39;évaluation de la taille SCTM, en particulier dans MCTSes, partiellement désintégrés traités avec le médicament qui ne possèdent pas une limite clairement définie pour la mesure de l&#39;aire de section transversale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Low-melting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCOY&#39;s 5A Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;rapid&#8221; Filtermax filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99505</td>
			<td>0.22 &#956;m, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop&#8482; Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Tube Dispensing cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24073295</td>
			<td>Metal tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well TC plate&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057308</td>
			<td>Plate type- CellCarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tube Dispensing Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroClime Environmental Lid</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LLS-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Incubator (SteriStore )</td>
			<td>HighRes Biosolutions</td>
			<td>23641</td>
			<td>Serial No.: D00384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: EL406&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: CV7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Express recombinant cell dissociation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates

Modèles de tumeur qui imitent étroitement dans des conditions in vivo sont de plus en plus populaire dans la découverte de médicaments et le développement pour le criblage de médicaments potentiels contre le cancer. Sphéroïdes de tumeur multicellulaires (MCTSes) imitent effectivement les conditions physiologiques des tumeurs solides, ce qui les rend excellents modèles in vitro pour l&#39; optimisation du plomb et la validation de cibles. Sur les diverses techniques disponibles pour la culture SCTM, la méthode de liquide superposition sur agarose est l&#39;une des méthodes les plus économiques pour la production SCTM. Cependant, le transfert fiable des cultures SCTM utilisant liquide overlay pour le criblage à haut débit peut être compromise par un certain nombre de limitations, y compris le revêtement de plaques de microtitrage (PM) avec agarose et la reproductibilité de la formation MCTS uniforme à travers les puits. Les députés sont nettement sujettes à des effets de bord qui résultent de l&#39;évaporation excessive du milieu de l&#39;extérieur de la plaque, ce qui empêche l&#39;utilisation de la totalité de la plaque pour la droguetests. Ce manuscrit fournit des améliorations techniques détaillées à la technique de liquide overlay pour augmenter l&#39;évolutivité et la reproductibilité de la formation uniforme SCTM. En outre, des détails sur un outil logiciel simple, semi-automatique, et universellement applicable pour l&#39;évaluation des SCTM caractéristiques après le traitement médicamenteux est présenté.

La perte inégale de milieu, en particulier des puits périphériques, est un problème fréquemment rencontré dans les PM avec de petits volumes de culture. Sensiblement l&#39; amélioration des conditions de culture, telles que les incubateurs avec température / systèmes d&#39;humidification bien contrôlée et les députés de l&#39; évaporation de réduction et les couvercles de la plaque, de réduire la perte significative de milieu dans les puits 8. Pour...

Watch this Scientific Journal Video about Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates at JoVE.com

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

La perte inégale de milieu à partir de plaques de microtitrage affecte la reproductibilité des multicellulaire formation sphéroïde tumorale uniforme. L&#39;amélioration des conditions de culture pour réduire la perte moyenne significative permettra d&#39;améliorer la reproductibilité de la formation sphéroïde et les résultats des essais à base de sphéroïde-en utilisant la technique de liquide overlay.

L&#39;évaporation de réduction Culture Condition Augmente la reproductibilité de la formation multicellulaire Spheroid en plaques de microtitration

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

Une méthode générale pour la détection des Nitrosamide Formation du métabolisme In Vitro des Nitrosamines par Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

La microscopie en immunofluorescence de γH2AX et 53BP1 pour l’analyse de la Formation et la réparation des cassures Double brin de l’ADN

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Vérifier dans un modèle de Culture cellulaire 3D basé sur l’ellipsoïde tête et cou, carcinome épidermoïde de la thérapie

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Un modèle de peau 3D organotypique mélanome sphéroïde

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentialisation des anticorps anticancéreux efficacité par les médicaments anticancéreux : détection des anticorps-médicament synergie à l’aide de l’équation d’indice de combinaison

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Identification, Caractérisation histologique et Dissection des Lobes de la Prostate souris pour modèles In Vitro sphéroïde 3D Culture

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...