Name: evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממשרד החינוך הצ&#39;כי, הנוער והספורט (LO1304) והסוכנות הטכנולוגית של צ&#39;כיה (TE01020028). המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר לאקשמן ורנאסי שהקדיש תמונות סטילס של עפעפיים סביבתיים.

1. הכנת צלחות מצופות Agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 0.75 גרם של נקודת agarose התכה נמוכה ולהוסיף אותו ל -100 מ&quot;ל של מדיום 5A של מקוי (עם או ללא פנול אדום) ללא בסרום. מחממים את הפתרון במיקרוגל ו מערבולת כל 1-2 דקות כדי לפזר את agarose לחלוטין. חיטוי הפתרו?...

<ol>
	<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+An+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening.">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer.">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).</li><li>Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+angiogenic+capability+is+regulated+by+3D+culture+and+integrin+engagement.">Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).</li><li>Lao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+to+Generate+Spheroid+Cultures+from+Tumor+Cells,+Tumor+Cells+&amp;+Fibroblasts+or+Tumor-Fragments:+Microenvironment,+Microvesicles+and+MiRNA.">Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells &amp; Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).</li><li>Wenzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-content+screening+for+the+identification+of+compounds+that+target+cells+in+dormant+tumor+spheroid+regions.">3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions.</a> Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis:+High-Throughput+Screening+Assay+Development,+Validation,+and+Pilot+Screen.">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li><li>Das, V., F&#252;rst, T., Gursk&#225;, S., D&#382;ub&#225;k, P., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates:+The+Effect+of+Medium+Evaporation.">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li><li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+imaging-based+platform+for+high-content,+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models.">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).</li><li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics.">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li><li>Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models.">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Cost+Efficient+Method+to+Avoid+Unequal+Evaporation+in+Cellular+Screening+Assays,+Which+Restores+Cellular+Metabolic+Activity.">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li><li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays.">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes.">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures.">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids:+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically.">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).</li></ol>

ציפוי צלחות TC 384 ובכן עם מסונן Agarose המנהג הסטנדרטי לוט הוא להשתמש נקודת agarose 1-1.5% התכה נמוכה כדי לצפות את הצלחות, המחייבת את agarose ו / או יחידת ניפוק להישמר מחומם כדי למנוע את gelling של agarose 6. Gelling של agarose הוא דאגת פוטנציאל בעת ה?...

תאים סרטניים בגידולים מסודרים פיסיולוגי מבנה מורכב, 3-ממדי (3D) המוקף מטריקס ותאי אינטראקציה. כמו כמעט כל התאים ברקמות מתגוררים בסביבת 3D, הצורך יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במודלי גידול במבחנה מחקות תכונות גידול הביא לפיתוח טכניקות תרבות 3D מספר 1, 2, 3. מודלים אלה עכשיו הופכים כלי מחקר בסיסיים עבור לומד את התפקיד של microenvironment הגידול על תגובה גרורה ותא כדי רפוי ב -3 D 2. יתר על כן, לעומת 2-ממדים (2D) תא תרבויות 4, מודלי 3D לאפשר הבנה טובה יותר של אינטראקציות גידולי stroma, אשר משפיעות מסלולי איתות תאיים. spheroids גידול התאי (MCTSes) של שורות תאים סרטניות נמצא בשימוש תדיר ג תאי 3Dמודלים ulture בשל הקרבה היחסית שלהם גידולים in vivo. מתוך מספר הטכניקות בשימוש, טכניקת כיסוי-הנוזלית (הרבה) של דור MCTS על צלחות מצופות agarose צברה עניין משמעותי עבור אימות אופטימיזציה עופרת יעד 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. הדבר ניכר מן המחקרים האחרונים כי הצליחו בהצלחה לרוץ מסכי טייס של ספריות מתחמות בתרבויות MCTS באמצעות לוט 6, 7. עם זאת, גם ל-גם השתנות במורפולוגיה MCTS וצמיחה עקב האובדן האחיד הנגרם האידוי של מדיום הם מכשולים נפוצים שמלווים במגרש באמצעות צלחות microtiter (חברי הפרלמנט). כתוצאה מכך, ההיווצרות של לא אחידה MCTSes פשרות המשמעות ורלוונטיתנתוני מבחנים תרופתיים 8, 12, 13. בנוסף לנושאי השחזור, בעיה מעשית אחר המשפיעה מבחני תפוקה גבוהה מבוססות לוט הוא הציפוי של חברי הפרלמנט עם agarose בעת השימוש נוזלי אוטומטית מחלק יחידות. למרות היחידה מהחלק יכולה להישמר מחוממת כדי למנוע את gelling של agarose, הסתימה של קלטת מחלק הצינורות היא דאגת פוטנציאל מערכות רובוטיות 6. כדי להתגבר על חלק מהאתגרים הללו, אנו פתחנו לאחרונה כמה שינויים במגרש עבור MCTS תרבות 8. שינויים אלה מבוססים בעיקר על דרכים אפשריות למניעת נשירה בינונית אחידה מן החברים הפרלמנט באמצעות מכשירים מצויים לרוב במעבדות הקרנת תפוקה גבוהה. נוהל מפורט של המגרש שונה עבור הדור של MCTSes בגודל לשחזור באופן אחיד על פני 384-גם צלחות (WPS) מוצגות כאן. כתב היד גם מציגה שגרה אוטומטית למחצה להערכת גודל MCTS, במיוחד בחלקו מתפורר, MCTSes מטופלים בתרופה כי אין גבול ברור למדידת שטח חתך.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Low-melting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCOY&#39;s 5A Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;rapid&#8221; Filtermax filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99505</td>
			<td>0.22 &#956;m, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop&#8482; Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Tube Dispensing cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24073295</td>
			<td>Metal tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well TC plate&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057308</td>
			<td>Plate type- CellCarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tube Dispensing Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroClime Environmental Lid</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LLS-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Incubator (SteriStore )</td>
			<td>HighRes Biosolutions</td>
			<td>23641</td>
			<td>Serial No.: D00384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: EL406&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: CV7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Express recombinant cell dissociation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates

מודלים גידול כי לחקות באופן הדוק בתנאים vivo הופכים פופולריים יותר ויותר גילוי ופיתוח תרופות להקרנה של תרופות נוגדות סרטן פוטנציאליים. Spheroids הגידול תאיים (MCTSes) ביעילות לחקות את התנאים הפיזיולוגיים של גידולים מוצקים, מה שהופך אותם מצוין במודלים חוץ גופית עבור אופטימיזציה להוביל ואימות היעד. מתוך הטכניקות השונות העומדות לתרבות MCTS, שיטת נוזלי כיסוי על agarose היא אחת השיטות הכי הזולות לייצור MCTS. עם זאת, ההעברה האמינה של תרבויות MCTS באמצעות נוזלי כיסוי להקרנת תפוקה גבוהה עלולה לסכן ידי מספר המגבלות, כולל הציפוי של צלחות microtiter (MPS) עם agarose ואת irreproducibility של היווצרות אחידה MCTS פני בארות. חברי פרלמנט נוטים באופן משמעותי בימים אלה לדחוק תופעות נובעות אידוי יתר של מדיום מן הצד החיצוני של הצלחת, למנוע את משך השימוש של הצלחת כולה על תרופהבדיקות. כתב יד זה מספק שיפורים טכניים מפורטים לטכניקה הנוזלת כיסוי כדי להגדיל את יכולת ההרחבה ואת השחזור של היווצרות MCTS האחידה. בנוסף, פרטים על כלי תוכנה פשוטה, חצי אוטומטי, וישים באופן אוניברסלי להערכת MCTS כולל לאחר טיפול תרופתי מוצג.

ההפסד לא השווה של מדיום, במיוחד מבארות פריפריה, הוא בעיה נתקלה לעתים קרובות חברי פרלמנט עם כרכי תרבות קטנים. באופן משמעותי תנאי תרבות משופרים, כגון חממות עם מבוקר היטב מערכות טמפרטורה / humidification וחברי פרלמנט מפחיתי אידוי מכסה בצלחת, להפחית את האובדן ה...

Watch this Scientific Journal Video about Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates at JoVE.com

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

ההפסד האחיד של מדיום מצלחות microtiter משפיע על השחזור של היווצרות אליפטית גידול רבה-תאיים אחידה. שיפור תנאי תרבות כדי לצמצם את אובדן בינוני משמעותי ישפר את השחזור של היווצרות אליפטית ותוצאות מבחנים מבוסס אליפטית בטכניקה הנוזלת כיסוי.

אידוי צמצום מצב התרבות מגביר את השחזור של גיבוש התאי אליפטית צלחות microtiter טובות

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

שיטה כללית לגילוי Nitrosamide היווצרות בחילוף החומרים במבחנה של Nitrosamines מאת ציטוכרום P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

מטריקס מבוסס על גידול אדם במלואו באופן שלוש מימדי הפלישה ספרואיד שיטת

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...