Name: evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00
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Este trabalho foi financiado por doações do Ministério checo da Educação, Juventude e Desporto (LO1304) e da Agência Tecnológica da República Checa (TE01020028). Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Lakshman Varanasi para tirar as imagens estáticas de tampas ambientais.

1. Preparação de placas de agarose revestidas <ol><li> Pesar 0,75 g de agarose de baixo ponto de fusão e adicioná-lo para 100 mL de meio de McCoy 5A (com ou sem vermelho de fenol) sem soro. Aquece-se a solução num forno de microondas e agite a cada 1-2 minutos para dissolver completamente a agarose. Autoclave a solução para esterilizá-lo. </li><li> Arrefece-se a autoclave de agarose a cerca de 70 ° C e filtra-se por uma de 500 ml, 0,22 um filtro de topo por filtração sob vácuo em uma caixa de fluxo lamina...

<ol>
	<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+An+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening.">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. 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M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models.">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Cost+Efficient+Method+to+Avoid+Unequal+Evaporation+in+Cellular+Screening+Assays,+Which+Restores+Cellular+Metabolic+Activity.">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li><li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays.">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes.">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures.">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids:+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically.">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).</li></ol>

Revestimento de 384 poços TC placas com filtrada Agarose A prática corrente no lote é a utilização de uma agarose de baixo ponto de fusão de 1-1,5% para revestir as placas, o que requer a agarose e / ou unidade de distribuição para ser mantido aquecido para impedir a gelificação da agarose 6. A gelificação da agarose é de interesse potencial ao preparar várias placas utilizando cassetes de distribuição de líquido com pequenas aberturas de tubos que varia...

As células cancerosas em tumores são fisiologicamente dispostos numa estrutura complexa, 3-dimensionais (3D) rodeado por matriz extracelular e células que interagem. Como quase todas as células em tecidos residir em um ambiente 3D, a necessidade de mais fisiologicamente relevante em modelos tumorais in vitro que imitam as características de tumor, resultou no desenvolvimento de várias técnicas de cultura 3D 1, 2, 3. Estes modelos estão agora a tornar-se ferramentas fundamentais de investigação para estudar o papel do microambiente do tumor em metástases de células e resposta a agentes terapêuticos em 3D 2. Além disso, em comparação com 2-dimensionais culturas de células (2d) 4, modelos 3D permitem uma melhor compreensão das interacções tumor do estroma, que afetam as vias de sinalização de células. esferóides multicelulares de tumores (MCTSes) de linhas celulares de cancro são frequentemente usados ​​na célula c 3Dmodelos ULTURA devido à sua proximidade em relação aos tumores in vivo. Dentre as diversas técnicas em uso, a técnica líquida de sobreposição (LOT) de geração de MCTS em placas revestidas de agarose ganhou um interesse significativo para a validação de otimização de chumbo e meta de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Isto é evidente a partir dos estudos recentes que foram capazes de executar telas piloto de bibliotecas de compostos em culturas MCTS usando LOT 6, 7 com sucesso. No entanto, a variabilidade de poço-a-poço na morfologia e crescimento MCTS devido à perda irregular induzida por evaporação do meio de barreiras são comuns que acompanham o lote utilizando placas de microtitulação (MPS). Consequentemente, a formação de MCTSes não uniforme compromete a importância e relevânciade dados de ensaios farmacológicos 8, 12, 13. Além dos problemas de reprodutibilidade, um outro problema prático que afecta ensaios de alto rendimento à base de lote é o revestimento das MPs com agarose quando se utiliza líquido automático unidades de fornecimento. Embora a unidade de distribuição pode ser mantido aquecido para evitar a gelificação de agarose, o entupimento da cassete de distribuição e tubagem é uma preocupação potencial para sistemas robóticos 6. Para superar alguns desses desafios, que recentemente inventou algumas modificações no lote de MCTS cultura 8. Estas modificações são baseadas principalmente em possíveis maneiras de evitar a perda de meio irregular das MPs, usando instrumentos que são comumente encontrados em laboratórios de rastreio de alto rendimento. Um procedimento pormenorizado do lote modificado para a geração de MCTSes de tamanho uniforme e reprodutível através trêsplacas de 84 poços (WPS) é aqui apresentado. O manuscrito apresenta também uma rotina semi-automatizado para a avaliação do tamanho de MCTS, particularmente em MCTSes parcialmente desintegradas, tratados com o fármaco que não têm um limite bem definido para a medição de área de secção transversal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Low-melting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCOY&#39;s 5A Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;rapid&#8221; Filtermax filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99505</td>
			<td>0.22 &#956;m, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop&#8482; Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Tube Dispensing cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24073295</td>
			<td>Metal tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well TC plate&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057308</td>
			<td>Plate type- CellCarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tube Dispensing Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroClime Environmental Lid</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LLS-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Incubator (SteriStore )</td>
			<td>HighRes Biosolutions</td>
			<td>23641</td>
			<td>Serial No.: D00384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: EL406&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: CV7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Express recombinant cell dissociation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates

Modelos de tumor que imitam de perto as condições in vivo estão a tornar-se cada vez mais popular na descoberta e desenvolvimento de medicamentos para o rastreio de potenciais drogas anti-cancro. Esferóides multicelulares (tumorais) MCTSes eficazmente imitar as condições fisiológicas de tumores sólidos, tornando-os excelentes em modelos in vitro para a optimização de chumbo e validação de alvos. Fora das várias técnicas disponíveis para a cultura de MCTS, o método líquida de sobreposição em agarose é um dos métodos mais barato para a produção de MCTS. No entanto, a transferência segura de culturas MCTS usando líquida de sobreposição para rastreio de alto rendimento podem ser comprometidas por um número de limitações, incluindo o revestimento de placas de microtitulação (MPs) com agarose e o irreproducibility de formação MCTS uniforme entre poços. MPs são significativamente propenso a efeitos de borda que resultam da evaporação excessiva de forma a partir do exterior da placa, evitando a utilização de toda a placa de drogatestes. Este manuscrito fornece melhorias técnicas detalhadas para a técnica líquida de sobreposição para aumentar a escalabilidade e reprodutibilidade da formação uniforme MCTS. Além disso, os pormenores sobre uma ferramenta de software simples, semi-automático, e universalmente aplicável para a avaliação das características de MCTS após o tratamento droga é apresentada.

A perda irregular de meio, principalmente a partir de poços periféricos, é uma questão frequentemente encontrada em MPs com volumes de cultura pequenas. Substancialmente melhores condições de cultura, tais como incubadoras com sistemas bem controlados temperatura / umidificação e deputados de redução de evaporação e tampas de placas, reduzir a perda significativa de meio através poços 8. Para medir a evaporação relativa, volumes iguais de Orange G ...

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Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

A perda irregular do meio de placas de microtitulação afecta a reprodutibilidade de formação de esferóides de tumor multicelular uniforme. A melhoria das condições de cultura de forma a reduzir a perda significativa vai melhorar a reprodutibilidade de formação de esferóides e os resultados de ensaios baseados em esferóides utilizando a técnica de sobreposição de líquido.

A evaporação de redução de Cultura condição aumenta a reprodutibilidade da Formação multicelular esferoidal em placas de microtitulação

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Research

JoVE Journal

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