Name: evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами от чешского Министерства образования, молодежи и спорта (LO1304) и Технологического Агентства Чешской Республики (TE01020028). Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Lakshman Варанаси для съемки неподвижных изображений с окружающей средой крышками.

1. Подготовка пластин, покрытых агарозой <ol><li> Взвешивают 0,75 г легкоплавкой агарозе и добавить его к 100 мл среды 5А Маккоя (с или без фенола красного) без сыворотки. Раствор нагревают в микроволновой печи и вихрем через каждые 1-2 мин до полного растворения агарозы. Автоклава решение стери?...

<ol>
	<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+An+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening.">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer.">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).</li><li>Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+angiogenic+capability+is+regulated+by+3D+culture+and+integrin+engagement.">Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).</li><li>Lao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+to+Generate+Spheroid+Cultures+from+Tumor+Cells,+Tumor+Cells+&amp;+Fibroblasts+or+Tumor-Fragments:+Microenvironment,+Microvesicles+and+MiRNA.">Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells &amp; Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133895 (2015).</li><li>Wenzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+high-content+screening+for+the+identification+of+compounds+that+target+cells+in+dormant+tumor+spheroid+regions.">3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions.</a> Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis:+High-Throughput+Screening+Assay+Development,+Validation,+and+Pilot+Screen.">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li><li>Das, V., F&#252;rst, T., Gursk&#225;, S., D&#382;ub&#225;k, P., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates:+The+Effect+of+Medium+Evaporation.">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li><li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+imaging-based+platform+for+high-content,+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models.">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).</li><li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics.">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li><li>Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models.">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Cost+Efficient+Method+to+Avoid+Unequal+Evaporation+in+Cellular+Screening+Assays,+Which+Restores+Cellular+Metabolic+Activity.">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li><li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays.">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes.">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures.">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids:+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically.">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).</li></ol>

Покрытие 384-TC Пластины с фильтрованной агарозном Стандартной практикой в LOT является использование 1-1.5% низкой температурой плавления агарозы для покрытия пластин, что требует агарозы и / или дозирующее устройство Удержаться нагревают , чтобы предотвратить гелеобразован...

Раковые клетки в опухоли физиологически расположены в комплексе, 3-мерные (3D) структуры, окруженной внеклеточного матрикса и взаимодействующих клеток. Поскольку почти все клетки в тканях располагаются в 3D - среде, потребность в более физиологически актуальной в пробирке моделях опухолей , которые имитируют опухолевые черты привело к разработке нескольких 3D методов культивирования 1, 2, 3. Эти модели в настоящее время становятся фундаментальные инструменты исследования для изучения роли микроокружения опухоли на метастазирование и клеточной реакции на терапии в 3D 2. Кроме того, по сравнению с 2-мерных (2D) клеточных культур 4, 3D - модели позволяют лучше понять опухоли стромы взаимодействий, которые влияют на клеточные сигнальные пути. Многоклеточных опухолевых сфероидов (MCTSes) линий раковых клеток часто используются в 3D Cell CМодели ulture из - за их относительной близости к опухолям в естественных условиях. Из нескольких методов в использовании, жидкость-оверлей техника (LOT) генерации MCTS на агарозном пластинок , покрытых приобрел значительный интерес для оптимизации свинца и целевой проверки 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Это видно из последних исследований , которые были успешно в состоянии запустить пилотные экраны библиотек соединений в MCTS культур с использованием LOT 6, 7. Тем не менее, хорошо к скважине изменчивости в MCTS морфологии и роста за счет испарения, вызванной неравномерным потери среды являются обычными препятствиями, которые сопровождают LOT с использованием микротитрационных планшетов (ОББ). Следовательно, формирование неравномерной MCTSes ставит под угрозу значимость и актуальностьданных , полученных из фармакологической анализов 8, 12, 13. В дополнение к проблемам воспроизводимости, другая практическая проблема, которая затрагивает LOT, основанные на высокой пропускной способности анализов является покрытие из депутатов с агарозы при использовании автоматической жидкости раздаточного устройства. Несмотря на то, дозирующий узел может быть нагретый , чтобы предотвратить гелеобразование агарозы, засорение раздаточного кассеты и трубки является потенциальной проблемой для роботизированных систем 6. Для преодоления некоторых из этих проблем, в последнее время мы разработали несколько модификаций в LOT для MCTS культуры 8. Эти изменения в основном базируются на возможных путях предотвращения неравномерного потери среды от депутатов с помощью инструментов, которые обычно встречаются в высокой пропускной способности скрининговых лабораторий. Детальная процедура модифицированного LOT для генерации одинакового размера и воспроизводимых MCTSes через 384-луночные планшеты (WPS) здесь представлена. Рукопись также представляет собой полуавтоматическую процедуру для оценки размера MCTS, особенно в частично разрушенными, обработанными наркотиками MCTSes, которые не имеют четко определенную границу для измерения площади поперечного сечения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Low-melting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCOY&#39;s 5A Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;rapid&#8221; Filtermax filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99505</td>
			<td>0.22 &#956;m, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop&#8482; Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Tube Dispensing cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24073295</td>
			<td>Metal tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well TC plate&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057308</td>
			<td>Plate type- CellCarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tube Dispensing Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroClime Environmental Lid</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LLS-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Incubator (SteriStore )</td>
			<td>HighRes Biosolutions</td>
			<td>23641</td>
			<td>Serial No.: D00384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: EL406&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: CV7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Express recombinant cell dissociation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates

Модели опухолей , которые близко имитируют в естественных условиях становятся все более популярными в новых лекарств и развития для скрининга потенциальных противоопухолевых препаратов. Многоклеточные опухолевые сфероиды (MCTSes) эффективно имитировать физиологические условия солидных опухолей, что делает их отличным в моделях пробирке для свинца оптимизации и целевой проверки. Из различных методов, доступных для MCTS культуры, жидкость-оверлей методом на агарозном является одним из самых недорогих способов генерации MCTS. Тем не менее, надежная передача МСТ культур с использованием жидкого-наложению для высокопроизводительного скрининга может быть поставлена ​​под угрозу ряд ограничений, в том числе покрытия микротитровальных пластин (ОББ) агарозой и невоспроизводимости равномерного формирования MCTS поперек скважин. Депутаты значительно склонны к краевыми эффектами, которые являются результатом чрезмерного испарения среды из наружной поверхности пластины, предотвращая использование всей пластины для лекарственного средстватесты. Эта рукопись содержит подробные технические усовершенствования жидкости наложения техники для повышения масштабируемости и воспроизводимости равномерного формирования MCTS. Кроме того, подробные сведения о простом, полуавтоматической и универсально применимой программный инструмент для оценки MCTS особенности после того, как лекарственная терапия представлена.

Неравномерное потеря среды, особенно из периферийных скважин, является часто встречающийся вопрос в депутаты с небольшими объемами культуры. Значительно улучшенные условия культивирования, такие как инкубаторы с хорошо контролируемой температуры / систем увлажнен?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates at JoVE.com

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Неравномерное потери среды от микротитровальных пластин влияет на воспроизводимость однородного многоклеточного образования опухоли сфероида. Улучшение условий культивирования, чтобы уменьшить значительную потерю среды улучшит воспроизводимости сфероида формирования и результаты анализов на основе сфероида с использованием жидкости наложения техники.

Испарение снижающих культуры Состояние увеличивает Воспроизводимость многоклеточных сфероида образования в микротитрационных планшетах

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

Генеральный метод для обнаружения Nitrosamide формирование в метаболизм в Vitro нитрозамины, цитохром P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 для анализа формирования и ремонт двухнитевые разрывы ДНК

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Терапия, тестирование в модели культуры на основе сфероида 3D клеток для головы и шеи плоскоклеточный рак

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

Всеобъемлющей процедуры для оценки производительности в Vitro предполагаемый Гемангиобластома неоваскуляризация, используя сфероида прорастания Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Модель 3D Organotypic меланомы кожи сфероида

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Потенцирование эффективности противоопухолевой антитела, противоопухолевые препараты: обнаружение антител наркотиков синергизм с помощью комбинации индекс уравнения

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Идентификация, Гистологическая характеристика и рассечение мыши простаты лопастями для в Vitro 3D сфероида культура модели

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Убийство Assay сфероида клетками T автомобилей

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Полностью человека опухоли на основе матрицы в трехмерном Сфероидных вторжения анализ

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...