Name: evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Educación Checa, Juventud y Deportes (LO1304) y la Agencia Tecnológica de la República Checa (TE01020028). Los autores desean agradecer al Dr. Lakshman Varanasi para tomar las imágenes fijas de tapas ambientales.

1. Preparación de placas recubiertas con agarosa <ol><li> Pesar 0,75 g de agarosa de bajo punto de fusión y añadirlo a 100 ml de medio 5A de McCoy (con o sin rojo fenol) sin suero. Calentar la solución en un horno de microondas y agitar cada 1-2 min para disolver completamente la agarosa. Autoclave la solución para esterilizarlo. </li><li> Se enfría la autoclave de agarosa a aproximadamente 70 ° C y filtrar a través de un 500 mL, 0,22 micras filtro superior por filtración a vacío en una caja de flujo laminar...

<ol>
	<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three-dimensional+(3D)+models+in+cancer+research:+An+update.">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li><li>Das, V., Bruzzese, F., Kone&#269;n&#253;, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening.">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. 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Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis:+High-Throughput+Screening+Assay+Development,+Validation,+and+Pilot+Screen.">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li><li>Das, V., F&#252;rst, T., Gursk&#225;, S., D&#382;ub&#225;k, P., Hajd&#250;ch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates:+The+Effect+of+Medium+Evaporation.">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li><li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+imaging-based+platform+for+high-content,+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models.">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751 (2014).</li><li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics.">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li><li>Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models.">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+and+Cost+Efficient+Method+to+Avoid+Unequal+Evaporation+in+Cellular+Screening+Assays,+Which+Restores+Cellular+Metabolic+Activity.">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li><li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays.">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103 (2016).</li><li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes.">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li><li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures.">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li><li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids:+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically.">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639 (2014).</li></ol>

El recubrimiento de placas de 384 pocillos con filtro de CT con agarosa La práctica estándar en la LOT es utilizar un punto de agarosa de baja fusión 1-1,5% para recubrir las placas, lo que requiere la agarosa y / o unidad de distribución que deben tenerse climatizada para evitar la gelificación de la agarosa 6. La gelificación de la agarosa es materia de preocupación mientras se prepara múltiples platos usando casetes de dispensación de líquido con pequeñas a...

Las células de cáncer en los tumores están dispuestos fisiológicamente en una estructura compleja, 3 dimensiones (3D), rodeada de matriz extracelular y células que interactúan. Como casi todas las células en los tejidos residen en un entorno 3D, la necesidad de más fisiológicamente relevante en modelos de tumores in vitro que imitan los rasgos tumorales se ha traducido en el desarrollo de varias técnicas de cultivo 3D 1, 2, 3. Estos modelos se están convirtiendo en herramientas fundamentales de investigación para estudiar el papel del microambiente del tumor en respuesta metástasis y celular a la terapéutica en 3D 2. Por otra parte, en comparación con 2-dimensionales cultivos celulares (2D) 4, los modelos 3D permiten una mejor comprensión de las interacciones tumor-estroma, que afectan a las vías de señalización celulares. esferoides tumorales multicelulares (MCTSes) de líneas celulares de cáncer se utilizan con frecuencia en la celda 3D cULTURA modelos debido a su relativa cercanía a los tumores in vivo. Fuera de las varias técnicas en uso, la técnica de los líquidos de recubrimiento (LOT) de la generación de MCTS en placas de agarosa recubiertas de ha ganado un interés significativo para la optimización de plomo y de destino de validación 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Esto es evidente en los recientes estudios que fueron éxito capaz de ejecutar las pantallas piloto de bibliotecas de compuestos en cultivos MCTS utilizando el lote 6, 7. Sin embargo, la variabilidad del pozo a pozo en MCTS morfología y crecimiento debido a la pérdida de evaporación desigual inducida del medio son obstáculos comunes que acompañan a la LOT usando placas de microtitulación (MPs). En consecuencia, la formación de no uniforme MCTSes compromete la importancia y relevanciade los datos de ensayos farmacológicos 8, 12, 13. Además de los problemas de reproducibilidad, otro problema práctico que afecta a ensayos de alto rendimiento basado en lotes es el recubrimiento de los parlamentarios con la agarosa utilizando las unidades de dispensación automático de líquidos. Aunque la unidad de distribución se puede mantener calienta a prevenir la gelificación de agarosa, la obstrucción de la cassette de distribución y el tubo es un problema potencial para los sistemas robóticos 6. Para superar algunos de estos desafíos, hemos ideado recientemente algunas modificaciones en el lote para el cultivo de MCTS 8. Estas modificaciones se basan principalmente en las posibles formas de prevenir la pérdida de medio desigual de los parlamentarios que utilizan instrumentos que se encuentran comúnmente en los laboratorios de análisis de alto rendimiento. Un procedimiento detallado de la LOT modificado para la generación de MCTSes de tamaño uniforme y reproducible a través de 3placas de 84 pocillos (WP) se presentan aquí. El manuscrito también presenta una rutina de semi-automatizado para la evaluación del tamaño de MCTS, en particular en MCTSes parcialmente desintegradas, tratados con el fármaco que no tienen un límite claramente definido para la medición del área en sección transversal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Low-melting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCOY&#39;s 5A Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8220;rapid&#8221; Filtermax filter</td>
			<td>TPP</td>
			<td>99505</td>
			<td>0.22 &#956;m, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop&#8482; Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5840300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Tube Dispensing cassette&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24073295</td>
			<td>Metal tip&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well TC plate&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6057308</td>
			<td>Plate type- CellCarrier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tube Dispensing Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24072670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroClime Environmental Lid</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td>LLS-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Incubator (SteriStore )</td>
			<td>HighRes Biosolutions</td>
			<td>23641</td>
			<td>Serial No.: D00384</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: EL406&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Content Imaging System (CellVoyager )</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation</td>
			<td>Unspecified</td>
			<td>Model: CV7000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7022S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Express recombinant cell dissociation reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12604021</td>
			<td>Phenol red free</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaporation-reducing culture condition increases the reproducibility of multicellular spheroid formation in microtiter plates

Modelos de tumores que imitan estrechamente las condiciones in vivo se están volviendo cada vez más popular en el descubrimiento de fármacos y el desarrollo para el cribado de posibles fármacos contra el cáncer. Esferoides tumorales multicelulares (MCTSes) imitan efectivamente las condiciones fisiológicas de los tumores sólidos, haciéndolos excelente en modelos in vitro para la optimización de plomo y la validación de dianas. Fuera de las diversas técnicas disponibles para el cultivo de MCTS, el método líquido superposición de agarosa es uno de los métodos más económicos para la generación de MCTS. Sin embargo, la transferencia fiable de cultivos MCTS utilizando líquido de recubrimiento para la selección de alto rendimiento puede verse comprometida por una serie de limitaciones, incluyendo el recubrimiento de placas de microtitulación (MP) con agarosa y la irreproducibilidad de la formación de MCTS uniforme a través de pozos. MPs son significativamente propensos a los efectos de borde que resultan de la evaporación excesiva de medio desde el exterior de la placa, evitando el uso de toda la placa para la drogapruebas. Este manuscrito ofrece mejoras técnicas detalladas a la técnica de superposición de líquido para aumentar la escalabilidad y la reproducibilidad de la formación uniforme de MCTS. Además, los detalles de una herramienta de software simple, semi-automático, y universalmente aplicable para la evaluación de las características de MCTS después se presenta el tratamiento de drogas.

La pérdida desigual del medio, sobre todo de los pozos periféricos, es un problema frecuentemente encontrado en los parlamentarios con pequeños volúmenes de cultivo. Condiciones de cultivo sustancialmente mejoradas, tales como incubadoras con sistemas bien controlados de temperatura / humidificación y parlamentarios de evaporación reductores y tapas de placas, reducen la pérdida significativa de la media en todos los pozos 8. Para medir la evaporación rela...

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Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

La pérdida desigual de medio de placas de microtitulación afecta a la reproducibilidad de la formación de esferoides de tumor multicelulares uniforme. La mejora de las condiciones de cultivo para reducir la pérdida significativa medio mejorará la reproducibilidad de la formación de esferoides y los resultados de los ensayos basados ​​en esferoides utilizando la técnica de los líquidos de recubrimiento.

La evaporación de reducción de Cultura condición aumenta la reproducibilidad del esferoide multicelular Formación en placas de microtitulación

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

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Investigación

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