Name: using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells at JoVE.com

This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. رقاقة السيليكون قالب التصنيع ملاحظة: تم تصميم الضوئية الرئيسية مع برنامج أوتوكاد وتصنيعها من قبل شركة تجارية. هذا التصميم يحتوي على ثلاث طبقات من أنماط مختلفة ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">ملف التكميلي 1</a> ). مرتفعات ?...

<ol>
	<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+High-tech+yeast+ageing.">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li><li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies.">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast.">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143 (2013).</li><li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system.">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length.">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li><li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast:+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p/Msn4p+and+Hsf1p+regulons.">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li><li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+the+yeast+G1/S+switch.">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).</li></ol>

يحتاج إلى أن تقدم طازجة الجهاز PDMS. وإلا فإن فقاعات الهواء الناجم عن إدخال الأنابيب في الجهاز يكون من الصعب إزالتها. الخطوة 3.4 هامة لتحسين كفاءة الخلايا تحميل من خلال التركيز الخلايا. لزيادة سرعة نقل التجربة، من 4 إلى 6 وحدات على الشريحة نفسها PDMS متصلة تستخدم مضخات تعمل ...

في مهدها الخميرة يعد مصدرا قويا لنموذج حي في الشيخوخة البحوث. ومع ذلك، فحص عمر التقليدية في الخميرة يعتمد على تسليخ مجهري، وهو عمل ليس فقط المكثف ولكن أيضا انخفاض الإنتاجية 1 و 2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج التقليدي تسليخ مجهري لا يقدم على عرض تفصيلي لمختلف الخصائص الخلوية والجزيئية في الخلايا الأم واحدة مع تقدمهم في السن. وقد مكن تطوير أجهزة ميكروفلويديك إجراء الآلي لقياس الخميرة عمر وكذلك لمتابعة الواسمات الجزيئية ومختلف الظواهر الخلوية في مختلف مراحل العمر من الخلايا الأم 3، 4، 5، 6، 7، 8. بعد تحميل خلايا الخميرة في جهاز ميكروفلويديك، فإنها يمكن تتبع تحت المجهر باستخدام التلقائي الوقت فاتالبريد التصوير. مع مساعدة من التصوير تجهيز الأدوات، ومختلف الظواهر الخلوية والجزيئية يمكن استخراج 3، 6، 8، بما في ذلك عمر، حجم، مراسل فلوري، مورفولوجيا الخلايا، وديناميات دورة الخلية، وما إلى ذلك، وكثير منها يصعب أو يستحيل الحصول باستخدام طريقة تسليخ مجهري التقليدي. اكتسبت أجهزة ميكروفلويديك مكانة بارزة في البحوث الخميرة الشيخوخة منذ التطوير الناجح من قبل بضع سنوات 3 و 4 و 6 و 7. وقد نشرت عدة مجموعات في وقت لاحق على أشكال مختلفة من التصاميم السابقة 5، والعديد من معامل الخميرة قد استخدمت أجهزة ميكروفلويديك لدراستهم. في ثقافة خلية تشهد نموا مطردا، وعدد الخلايا الأم في سن المتوفرة للمراقبة هو miniscuجنيه. ولذلك، فإن مبدأ التصميم العام للجهاز ميكروفلويديك لقياس عمر هو الإبقاء الخلايا الأم ولإزالة الخلايا الوليدة. واحدة من هذه التصاميم يستفيد من حقيقة أن الخميرة يخضع انقسام الخلايا غير المتماثلة. الهياكل في الخلايا الأم إرادة جهاز فخ اكبر وتسمح للخلايا ابنته الصغيرة التي يجب غسلها بعيدا. يستخدم رقاقة ميكروفلويديك الموصوفة في هذه المقالة polydimethylsiloxane لينة (PDMS) لوحة (الأعمدة متدل العمودي) إلى خلايا فخ الأم (الشكل 1). وقد تم الإبلاغ عن الأجهزة من تصميم مماثل سابقا 3 و 4 و 6 و 7. يستخدم هذا البروتوكول إجراء أبسط لصنع أجهزة ميكروفلويديك واضحة طريقة خلية التحميل التي يتم أمثل للتجارب الوقت الفاصل بين التصوير. واحدة من المعالم الرئيسية في الجهاز ميكروفلويديك هو العرض من منصات PDMS تستخدم لخلايا فخ الأم. لدينا ديستخدم evice منصات أوسع يمكن أن تبقي أكثر من الخلايا الأم تحت كل لوحة، بما في ذلك جزء كبير من الخلايا الأم العذبة التي يمكن تتبعها طيلة حياتها. بالإضافة إلى قياسات عمر، وهذا البروتوكول هو مفيد لتجارب التصوير وحيد الخلية مرور الزمن عندما تحتاج لتعقبها لأجيال عديدة أو عند ملاحظة طوال العمر كله ضروري الخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3&#39;&#39; &#60;111&#62; silicon wafer</td>
			<td>Addison Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000 and 3000 Series</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>ellsworth</td>
			<td>2065622</td>
			<td>Include Sylgard&#174; silicone elastomer base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-core&#8482; punch(I.D. 0.75 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&#174; cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>102440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M&#160; Scotch Tape</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-10223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURE ETHANOL, KOPTEC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHOOSH-DUSTER&#8482;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL BD Syringe (Luer-Lock&#8482;Tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company.</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028)</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>SWTT-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Assortment</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>NEKIT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2238300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Oven</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>13246516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>TS-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

بعد التجارب، وأعمار من الخلايا والعديد من الظواهر الخلوية والجزيئية يمكن استخراجها من تسجيل الصور مرور الزمن. وبما أن هناك عددا من الميزات المختلفة التي يمكن استخلاصها من كل خلية، فإن الخطوة الأولى من التحليل هي لتعليم الخلايا والأحداث، بما في ذلك...

Watch this Scientific Journal Video about Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells at JoVE.com

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

تقدم هذه المقالة بروتوكول الأمثل لإنتاج رقائق ميكروفلويديك وإعداد التجارب الموائع الدقيقة لقياس عمر والظواهر الخلوية من خلايا الخميرة واحدة.

استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

الحصول على الإسفار الوقت الفاصل بين الأفلام من الخميرة في مهدها وتحليل ديناميات وحيدة الخلية باستخدام الطعوم

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

الكمي الزمانية التعبير MAPK المستحثة في خلايا الخميرة واحدة

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

ضربة قاضية الجينات على نطاق واسع في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام المكتبات تغذية الرنا المزدوج الجديلة لتوليد قوية لتخفيف من وظيفة الظواهر

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

تحليل الزمانية المكانية من Cytokinetic الأحداث في الخميرة الانشطار

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...