Name: using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00
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This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. Silizium-Wafer-Form Fabrication HINWEIS: Die Photomaske mit AutoCAD-Software und hergestellt von einem kommerziellen Unternehmen entwickelt wird. Dieser Entwurf enthält drei Schichten von verschiedenen Mustern ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Zusatzdatei 1</a> ). Die Höhen der ersten, zweiten und dritten Schichten sind etwa 4 um, 10 um und 50 um betragen. Die Siliziumwafer Form wurde von der Photomaske unter Verwendung von Softlithographie <sup c...

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	<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Polymenis, M., Kennedy, B. 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Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+the+yeast+G1/S+switch.">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).</li></ol>

Das PDMS-Gerät muss frisch hergestellt werden. Andernfalls werden die Luftblasen, die durch Rohre in die Vorrichtung eingefügt schwer zu entfernen. Schritt 3.4 ist wichtig, um die Zellbeladungseffizienz zu verbessern, indem die Zellen konzentriert. Um den Durchsatz des Experimentes zu erhöhen, 4 bis 6-Module auf dem gleichen Chip verbunden PDMS unabhängig arbeitende Pumpen typischerweise verwendet werden, durchzuführen 4 bis 6 verschiedene Experimente (verschiedene Stämme oder Medienzusammensetzungen) gleichzeitig...

Bäckerhefe ist ein leistungsfähiger Modellorganismus in der Altersforschung. Jedoch beruht eine herkömmliche Assay Lebensdauer in Hefe auf Mikrodissektion, was nicht nur arbeitsintensiv , sondern auch geringen Durchsatz gleich 1, 2. Darüber hinaus ist die traditionelle microdissection Ansatz bieten nicht eine detaillierte Ansicht der verschiedenen zellulären und molekularen Merkmalen in den einzelnen Mutterzellen, während sie altern. Die Entwicklung von Mikrofluidik - Vorrichtungen ist ein automatisiertes Verfahren zur Messung der Lebensdauer Hefe sowie zu folgen molekularen Marker und verschiedene zelluläre Phänotypen in der gesamten Lebensdauer der Mutterzellen 3, 4, 5, 6, 7, 8 freigegeben. Nach Hefezellen in eine Mikrofluidik-Vorrichtung geladen werden, können sie unter einem Mikroskop automatische zeit Runden unter Verwendung nachgeführte Bildgebung. Mit Hilfe von Bildverarbeitungswerkzeugen können verschiedene zelluläre und molekulare Phänotypen 3 extrahiert werden, 6, 8, einschließlich der Lebensdauer, Größe, Fluoreszenz - Reporter, Zellmorphologie, Zellzyklus - Dynamik usw., von denen viele schwer oder unmöglich zu erhalten ist unter Verwendung von die traditionellen Mikrodissektionsverfahren. Mikrofluidik - Vorrichtungen haben Prominenz in Hefe - Aging Forschung seit ihrer erfolgreichen Entwicklung gewonnen vor einigen Jahren 3, 4, 6, 7. Mehrere Gruppen haben auf Variationen der früheren Entwürfen 5 und viele Hefe - Labors haben mikrofluidischen Vorrichtungen anschließend veröffentlicht für ihre Studie beschäftigt. In einer Zellkultur exponentielles Wachstum erfährt, die Zahl der im Alter von Mutterzellen, die für die Beobachtung verfügbar sind, ist miniscule. Daher ist das allgemeine Konstruktionsprinzip der Mikrofluidik-Vorrichtung für Lebensdauer-Messungen Mutterzellen zu binden und Tochterzellen zu entfernen. Eine solche Konstruktionen machen Gebrauch von der Tatsache, dass Hefe Teilung asymmetrische Zelle unterzogen wird. Die Strukturen in dem Gerät Fall größere Mutterzellen und ermöglichen kleinere Tochterzellen weggespült werden. Der Mikrofluidik - Chip in diesem Artikel beschrieben ist, verwendet ein weiches Polydimethylsiloxan (PDMS) pad (vertikale pensile Spalten) abzufangen Mutterzellen (Abbildung 1). Geräte ähnlicher Bauart wurden bereits 3, 4, berichtet 6, 7. Dieses Protokoll verwendet ein einfacheres Verfahren mikrofluidischen Vorrichtungen herzustellen und eine einfache zellLadeVerfahren, die für die Zeitraffer-Imaging Experimente optimiert ist. Einer der wichtigsten Parameter in der Mikrofluidik-Vorrichtung ist die Breite der zu stoppen Mutterzellen verwendet PDMS-Pads. unsere device verwendet breitere Pads, die mehr Mutterzellen unter jedem Pad halten können, darunter ein großer Anteil der frischen Mutterzellen, die während ihrer gesamten Lebensdauer verfolgt werden können. Neben Lebensdauer Messungen ist dieses Protokoll für einzelne Zelle Zeitraffer-Imaging Experimente nützlich, wenn die Zellen während der gesamten Lebensdauer für viele Generationen oder wenn eine Beobachtung verfolgt werden müssen, ist notwendig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3&#39;&#39; &#60;111&#62; silicon wafer</td>
			<td>Addison Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000 and 3000 Series</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>ellsworth</td>
			<td>2065622</td>
			<td>Include Sylgard&#174; silicone elastomer base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-core&#8482; punch(I.D. 0.75 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&#174; cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>102440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M&#160; Scotch Tape</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-10223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURE ETHANOL, KOPTEC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHOOSH-DUSTER&#8482;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL BD Syringe (Luer-Lock&#8482;Tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company.</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028)</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>SWTT-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Assortment</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>NEKIT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2238300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Oven</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>13246516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>TS-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Nach den Experimenten können die Lebensdauer der Zellen und viele zelluläre und molekulare Phänotypen aus den aufgezeichneten Zeitraffer-Bilder extrahiert werden. Da es eine Reihe von verschiedenen Funktionen, die von jeder Zelle entnommen werden kann, ist der erste Schritt der Analyse der Zellen und Ereignisse mit Anmerkungen zu versehen, einschließlich der Positionen und Grenzen der Zellen und dem Timing der verschiedenen Ereignisse, die verfolgt werden, wie beispiels wie die angeh...

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Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Herstellung von Mikrofluidik-Chips und der Aufbau von mikrofluidischen Experimenten optimiert, um die Lebensdauer und zellulären Phänotypen einzelner Hefezellen zu messen.

Mikrofluidik-Geräte mit Measure Lebensdauer und Cellular Phänotypen in Einzel Budding Hefezellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Forschung

Biologie

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi-Screening auf postembryonalen Phänotypen in Identifizieren C elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Messung der Lebensdauer in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Acquiring Fluoreszenz Zeitraffer-Filme von Bäckerhefe und Analysieren von Einzel-Zell-Dynamics mit Transplantaten

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Groß Gene Knockdown in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwenden dsRNA Fütterung Bibliotheken zu Robust Loss-of-function Phänotypen generieren

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Bäckerhefe Protein Extraktion und Reinigung für das Studium der Funktion, Wechselwirkungen, und post-translationale Modifikationen

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...