Name: using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00
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This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. सिलिकॉन वेफर ढालना निर्माण नोट: photomask ऑटोकैड सॉफ्टवेयर के साथ बनाया गया है और एक वाणिज्यिक कंपनी द्वारा निर्मित है। इस डिजाइन विभिन्न पैटर्न (की तीन परतों में शामिल है <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" tar...

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	<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+High-tech+yeast+ageing.">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li><li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies.">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast.">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143 (2013).</li><li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system.">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. 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Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+the+yeast+G1/S+switch.">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).</li></ol>

PDMS डिवाइस हाल में किए जाने की जरूरत है। अन्यथा, हवा के बुलबुले डिवाइस में ट्यूब डालने की वजह से दूर करने के लिए कठिन हो जाएगा। चरण 3.4 कोशिकाओं ध्यान केंद्रित करके सेल लोड हो रहा है दक्षता में सुधार के लिए म...

नवोदित खमीर अनुसंधान उम्र बढ़ने में एक शक्तिशाली मॉडल जीव है। हालांकि, खमीर में एक पारंपरिक जीवन काल परख सूक्षम पर निर्भर करता है, जो न केवल श्रम गहन लेकिन यह भी कम प्रवाह क्षमता 1, 2 है। इसके अलावा, पारंपरिक सूक्षम दृष्टिकोण अकेली मां कोशिकाओं में विभिन्न सेलुलर और आणविक सुविधाओं का एक विस्तृत विवरण प्रदान नहीं करता है उनकी उम्र बढ़ने के। Microfluidic उपकरणों के विकास के खमीर उम्र को मापने के लिए और साथ ही मां कोशिकाओं 3, 4, 5, 6, 7, 8 की उम्र भर आणविक मार्कर और विभिन्न सेलुलर समलक्षणियों पालन करने के लिए एक स्वचालित प्रक्रिया में सक्षम बनाया है। बाद खमीर कोशिकाओं एक microfluidic युक्ति में लोड कर रहे हैं, वे स्वत: समय-लैप का उपयोग कर एक खुर्दबीन के नीचे ट्रैक किया जा सकताई इमेजिंग। प्रसंस्करण उपकरण इमेजिंग की मदद से, विभिन्न सेलुलर और आणविक समलक्षणियों 3 निकाला जा सकता है, 6, 8, उम्र, आकार, फ्लोरोसेंट संवाददाता, सेल आकृति विज्ञान, कोशिका चक्र की गतिशीलता, आदि, जिनमें से कई मुश्किल या असंभव का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए कर रहे हैं सहित पारंपरिक सूक्षम विधि। Microfluidic उपकरणों कुछ साल पहले 3, 4, 6, 7 उनके सफल विकास के बाद से खमीर उम्र बढ़ने अनुसंधान के क्षेत्र में प्रसिद्धि प्राप्त की है। कई समूह बाद में पहले डिजाइन 5 के रूपांतरों पर प्रकाशित किया है, और कई खमीर प्रयोगशालाओं उनके अध्ययन के लिए microfluidic उपकरणों कार्यरत हैं। एक सेल संस्कृति घातीय वृद्धि के दौर से गुजर में, वृद्ध मां कोशिकाओं है कि अवलोकन के लिए उपलब्ध हैं की संख्या miniscu हैle। इसलिए, उम्र मापन के लिए microfluidic डिवाइस के सामान्य डिजाइन सिद्धांत मां कोशिकाओं बनाए रखने के लिए और बेटी की कोशिकाओं को हटाने के लिए है। ऐसा ही एक डिजाइन तथ्य यह है कि खमीर असममित कोशिका विभाजन से होकर गुजरती है का उपयोग करता है। डिवाइस इच्छा जाल बड़ा मां कोशिकाओं में संरचनाओं और अनुमति देने के छोटे बेटी कोशिकाओं धुल जाने। Microfluidic चिप इस आलेख में वर्णित जाल मां कोशिकाओं को एक नरम polydimethylsiloxane (PDMS) पैड (ऊर्ध्वाधर लटकता हुआ कॉलम) (चित्रा 1) का उपयोग करता है। इसी तरह की डिजाइन की डिवाइस पहले से 3, 4, 6, 7 की जानकारी मिली है। यह प्रोटोकॉल microfluidic उपकरणों और एक सीधा सेल लोडिंग विधि है कि समय-अंतराल इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलित है निर्माण करने के लिए एक सरल प्रक्रिया का उपयोग करता। microfluidic युक्ति में महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक PDMS जाल मां कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया पैड की चौड़ाई है। हमारे घevice व्यापक पैड कि प्रत्येक पैड के तहत और अधिक मां कोशिकाओं रख सकते हैं, ताजा मां कोशिकाओं है कि उनके जीवन भर ट्रैक किया जा सकता का एक महत्वपूर्ण अंश सहित उपयोग करता है। उम्र माप के अलावा, इस प्रोटोकॉल एकल कक्ष समय-अंतराल इमेजिंग प्रयोगों के लिए उपयोगी जब कोशिकाओं कई पीढ़ियों या जब पूरे जीवन भर एक अवलोकन के लिए आवश्यक है के लिए नज़र रखी जा करने की आवश्यकता है।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3&#39;&#39; &#60;111&#62; silicon wafer</td>
			<td>Addison Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000 and 3000 Series</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>ellsworth</td>
			<td>2065622</td>
			<td>Include Sylgard&#174; silicone elastomer base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-core&#8482; punch(I.D. 0.75 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&#174; cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>102440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M&#160; Scotch Tape</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-10223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURE ETHANOL, KOPTEC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHOOSH-DUSTER&#8482;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL BD Syringe (Luer-Lock&#8482;Tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company.</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028)</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>SWTT-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Assortment</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>NEKIT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2238300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Oven</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>13246516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>TS-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

प्रयोगों के बाद, कोशिकाओं और कई सेलुलर और आणविक समलक्षणियों के जीवनकाल रिकॉर्ड किए गए समय-अंतराल छवियों से निकाला जा सकता। के बाद से वहाँ विभिन्न सुविधाओं कि प्रत्येक कोशिका से निकाला जा ?...

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Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

यह लेख एक प्रोटोकॉल microfluidic चिप्स के उत्पादन और microfluidic प्रयोगों की स्थापना के जीवन काल और एकल खमीर कोशिकाओं के सेलुलर समलक्षणियों को मापने के लिए के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करता है।

Microfluidic उपकरणों का उपयोग करते हुए एकल नवोदित खमीर कोशिकाओं में जीवनकाल और सेलुलर समलक्षणियों की माप के लिए

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

नवोदित खमीर में Replicative लाइफ स्पैन मापने

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

आरएनएआई स्क्रीनिंग में Postembryonic phenotypes पहचानें सी. एलिगेंस</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

उम्र के मापन में<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

नवोदित खमीर की प्रतिदीप्ति समय चूक सिनेमा हासिल करना और grafts का उपयोग कर एकल सेल गतिशीलता का विश्लेषण

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

एकल खमीर कोशिकाओं में MAPK प्रेरित अभिव्यक्ति की अस्थायी मात्रा

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

बड़े पैमाने पर जीन पछाड़ना में<em&gt; सी. एलिगेंस</em&gt; मजबूत घाटे का समारोह phenotypes उत्पन्न करने के लिए dsRNA दूध पिलाने पुस्तकालयों का उपयोग

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

समारोह का अध्ययन है, सहभागिता, और बाद translational संशोधनों के लिए नवोदित खमीर प्रोटीन निष्कर्षण और शोधन

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

मात्रात्मक, काइनेटिक और उच्च throughput नवोदित खमीर में endocytosis के विश्लेषण के लिए pHluorin के आवेदन

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

विखंडन खमीर में Cytokinetic घटनाक्रम spatiotemporal विश्लेषण

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

उच्च संकल्प इमेजिंग और नवोदित खमीर में व्यक्तिगत एस्ट्रल सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का विश्लेषण

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...