Name: using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00
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This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. 실리콘 웨이퍼 금형 제작 참고 : 포토 마스크 AutoCAD 소프트웨어 설계 및 상업 회사에 의해 제조된다. 이 디자인은 다른 패턴 (세 층을 포함 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">보충 파일 1</a> ). 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 층의 높이가 각각 약 4 ㎛의 10㎛, 및 50㎛의이다. 실리콘 웨이퍼 몰드 소프트 리소그래피 9, 10?...

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	<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+High-tech+yeast+ageing.">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li><li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies.">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast.">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143 (2013).</li><li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system.">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. 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Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+the+yeast+G1/S+switch.">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).</li></ol>

PDMS의 장치는 갓해야합니다. 그렇지 않으면, 장치에 관을 삽입함으로써 발생되는 기포를 제거하는 것이 어려울 것이다. 단계 3.4 세포를 집중하여 셀 로딩 효율을 개선하는 것이 중요하다. 실험의 처리량을 증가시키기 위해 동일한 PDMS 칩 4~6 모듈을 독립적으로 작동하는 펌프는 전형적으로 동시에 4~6 다른 실험 (상이한 균주 또는 미디어 조성물)을 수행하는 데 사용하기 위해 연결된다. <p class="j...

효모 신진 것은 노화 연구에서 강력한 모델 생물이다. 그러나 효모에서 기존의 수명 분석뿐만 아니라 노동 집약적뿐만 아니라 낮은 처리량 1, 2 인 미세 절제에 의존한다. 그들은 나이 또한, 기존의 미세 절제 방식은 하나의 어머니 세포에서 다양한 세포 및 분자 기능의 상세보기를 제공하지 않습니다. 미세 유체 장치의 개발은 효모 수명을 측정 할뿐만 아니라, 마더 셀 3, 4, 5, 6, 7, 8의 수명에 걸쳐 분자 마커 및 다양한 세포 표현형을 수행하는 자동화 된 방법을 사용할 수있다. 효모 세포는 미세 유동 장치에로드 된 후, 이들은 자동 시간 바퀴를 사용하여 현미경으로 추적 될 수있다전자 영상. 프로세싱 툴을 묘화의 도움으로, 다양한 세포 및 분자 표현형은 3 추출 할 수있다 (6)하여 얻는 것이 곤란 또는 불가능 이는 많은 등 수명, 크기, 형광 리포터 세포 형태학, 세포주기 역학 포함 8 기존의 미세 절제 방법. 미세 유체 장치는 몇 년 전 3, 4, 6, 7 성공적인 개발 이후 효모 노화 연구에 명성을 얻고있다. 몇몇 그룹은 이후에 이전 디자인 (5)의 변동에 게시 한 많은 효모 연구소는 연구를 위해 마이크로 유체 장치를 채택했다. 기하 급수적 인 성장을받은 세포 배양에서 관찰에 사용할 수있는 세 어머니 세포의 수는 miniscu입니다르. 따라서, 수명 측정을위한 마이크로 유체 장치의 일반적인 디자인 원칙은 어머니 세포를 유지하고 딸 세포를 제거하는 것입니다. 하나는 이러한 디자인은 효모는 비대칭 세포 분열을 겪는다는 사실을 사용한다. 다음은 장치 의지 트랩 큰 어머니 세포의 구조와 허용 작은 딸 세포가 씻겨합니다. 이 문서에서 설명하는 미세 유체 칩은 트랩 모 세포 연질 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 패드 (매달린 수직 열) (도 1)를 사용한다. 비슷한 디자인의 장치는 이전에 3, 4, 6, 7보고되었다. 이 프로토콜은 마이크로 유체 장치 및 저속 촬상 실험 최적화되어 직접적인 셀 로딩 방법을 제조하는 간단한 방법을 사용한다. 미세 유동 장치의 주요 매개 변수의 하나는 트랩 모 세포에 사용되는 PDMS 패드의 폭이다. 우리의 Device는 수명 전반에 걸쳐 추적 할 수 있습니다 신선한 어머니 세포의 상당 부분을 포함하여 각 패드에서 더 어머니 세포를 유지할 수 있습니다 넓은 패드를 사용합니다. 세포는 여러 세대하거나 전체 수명에 걸쳐 관찰이 필요 대해 추적 될 필요가있을 때 수명 측정에 더하여,이 프로토콜은 단일 세포 타임 랩스 영상 실험에 유용하다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>3&#39;&#39; &#60;111&#62; silicon wafer</td>
			<td>Addison Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000 and 3000 Series</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>ellsworth</td>
			<td>2065622</td>
			<td>Include Sylgard&#174; silicone elastomer base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-core&#8482; punch(I.D. 0.75 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&#174; cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>102440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M&#160; Scotch Tape</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-10223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURE ETHANOL, KOPTEC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHOOSH-DUSTER&#8482;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL BD Syringe (Luer-Lock&#8482;Tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company.</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028)</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>SWTT-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Assortment</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>NEKIT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2238300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Oven</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>13246516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>TS-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

실험 후, 균체 많은 세포와 분자 표현형의 수명은 녹화 시간 경과 화상으로부터 추출 할 수있다. 각 셀로부터 추출 될 수있는 다른 다양한 기능이 있기 때문에, 분석의 제 1 단계는, 위치 및 셀 경계 추적되고 각종 이벤트의 타이밍을 포함하는 세포 및 이벤트를 주석 등이다 신진 이벤트와 같은. 이러한 주석은 쉽게 미래에 다양한 기능을 세포의 동일한 세트로 복귀하고 분?...

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Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

이 문서에서는 마이크로 유체 칩의 생산과 수명 및 단일 효모 세포의 세포 표현형을 측정하는 미세 유체 실험의 설정에 최적화 된 프로토콜을 제공한다.

마이크로 유체 장치를 사용하면 단일 신진 효모 세포의 수명과 세포 표현형을 측정하는

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

연구

생물학

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

의 수명 측정<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

신진 효모의 형광 시간 경과 영화를 획득 및 이식을 사용하여 단일 세포 역학 분석

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

대규모 유전자 넉다운에<em&gt; C. 엘레</em&gt; 강력한 기능 상실 표현형을 생성하는 dsRNA를 먹이는 라이브러리 사용

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

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