Name: using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00
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This research was supported by NIH Grant AG043080 and the National Natural Science Foundation of China (NSFC), No. 11434001. We thank Lucas Waldburger for proofreading the manuscript.

1. Molde de fabricación de obleas de silicio NOTA: La fotomáscara se ha diseñado con el software AutoCAD y fabricado por una empresa comercial. Este diseño contiene tres capas de diferentes patrones ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">Archivo 1</a> ). Las alturas de la primera, segunda, y tercera capas son aproximadamente 4! M, 10 m, y 50! M, respectivamente. El molde oblea de silicio se ha creado a partir de la fotomáscara mediante litografía blan...

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	<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Polymenis, M., Kennedy, B. 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L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies.">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, ., Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast.">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143 (2013).</li><li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system.">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li><li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures.">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length.">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li><li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response+in+yeast:+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p/Msn4p+and+Hsf1p+regulons.">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li><li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+the+yeast+G1/S+switch.">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673 (2013).</li></ol>

El dispositivo de PDMS necesita ser recién hecho. De lo contrario, las burbujas de aire causadas por la inserción de tubos en el dispositivo serán difíciles de eliminar. Paso 3.4 es importante para mejorar la eficiencia de carga de células mediante la concentración de las células. Para aumentar el rendimiento del experimento, de 4 a 6 módulos en el mismo chip PDMS conectados a independiente bombas que operan normalmente se utilizan para realizar de 4 a 6 experimentos diferentes (diferentes cepas o composiciones ...

La levadura en ciernes es un poderoso organismo modelo en la investigación del envejecimiento. Sin embargo, un ensayo de vida útil convencional en levaduras se basa en la microdisección, que no sólo es un trabajo intensivo sino también bajo rendimiento 1, 2. Además, el enfoque de microdisección tradicional no proporciona una vista detallada de diversas características celulares y moleculares en las células madre individuales a medida que envejecen. El desarrollo de dispositivos microfluídicos ha permitido un procedimiento automatizado para medir la vida útil de la levadura, así como de seguir los marcadores moleculares y diferentes fenotipos celulares a lo largo de la vida útil de las células madre 3, 4, 5, 6, 7, 8. Después de células de levadura se cargan en un dispositivo de microfluidos, pueden ser rastreados bajo un microscopio usando el tiempo-vueltas automáticase imágenes. Con la ayuda de la formación de imágenes herramientas de procesamiento, diferentes fenotipos celulares y moleculares se pueden extraer 3, 6, 8, incluyendo la vida útil, el tamaño, el reportero fluorescente, la morfología celular, la dinámica del ciclo celular, etc., muchos de los cuales son difíciles o imposibles de obtener mediante el método tradicional de microdisección. Dispositivos de microfluidos han ganado importancia en la investigación de levadura envejecimiento, ya que su desarrollo con éxito hace unos años, 3, 4, 6, 7. Varios grupos han publicado posteriormente en variaciones de los diseños anteriores 5, y muchos laboratorios de levadura han empleado dispositivos de microfluidos para su estudio. En un cultivo de células sometidos a crecimiento exponencial, el número de células madre de edad que están disponibles para la observación es miniscuLe. Por lo tanto, el principio de diseño general del dispositivo de microfluidos para mediciones de vida útil es conservar las células madre y para eliminar las células hijas. Uno de estos diseños hace uso del hecho de que la levadura se somete a la división celular asimétrica. Las estructuras de las células madre de la trampa voluntad dispositivo más grandes y permitir que las células hijas más pequeñas para ser lavados. El chip microfluídico descrito en este artículo utiliza una almohadilla de polidimetilsiloxano suave (PDMS) (columnas Pensile verticales) a las células madre trampa (Figura 1). Dispositivos de diseño similar se ha informado anteriormente 3, 4, 6, 7. Este protocolo utiliza un procedimiento más sencillo para fabricar dispositivos microfluídicos y un método de la celda de carga sencilla que está optimizado para los experimentos de imagen de lapso de tiempo. Uno de los parámetros clave en el dispositivo de microfluidos es la anchura de las almohadillas de PDMS utilizados para células trampa madre. nuestra device utiliza almohadillas más amplios que pueden mantener más células madre en cada almohadilla, incluyendo una fracción significativa de células madre frescas que pueden rastrearse a lo largo de su vida útil. Además de las mediciones de vida útil, este protocolo es útil para los experimentos de imagen única célula de lapso de tiempo cuando las células necesitan ser rastreado por muchas generaciones o cuando una observación a lo largo de toda la vida útil es necesario.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3&#39;&#39; &#60;111&#62; silicon wafer</td>
			<td>Addison Engineering</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2000 and 3000 Series</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>ellsworth</td>
			<td>2065622</td>
			<td>Include Sylgard&#174; silicone elastomer base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-core&#8482; punch(I.D. 0.75 mm)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm x 40 mm SLIP-RITE&#174; cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>102440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M&#160; Scotch Tape</td>
			<td>ULINE</td>
			<td>S-10223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR&#174; Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PURE ETHANOL, KOPTEC</td>
			<td>VWR</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHOOSH-DUSTER&#8482;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5mL BD Syringe (Luer-Lock&#8482;Tip)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company.</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028)</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>SWTT-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Assortment</td>
			<td>COMPONENT SUPPLY COMPANY</td>
			<td>NEKIT-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>HACH</td>
			<td>2238300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Oven</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>13246516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>TS-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using microfluidic devices to measure lifespan and cellular phenotypes in single budding yeast cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Después de los experimentos, la vida útil de las células y muchos fenotipos celulares y moleculares se pueden extraer de las imágenes de lapso de tiempo grabados. Puesto que hay un número de diferentes características que se pueden extraer de cada celda, el primer paso del análisis es para anotar las células y eventos, incluyendo las posiciones y los límites de las células y la sincronización de los diversos eventos que se está realizando el seguimiento, tales como los aconte...

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Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Este artículo presenta un protocolo optimizado para la producción de chips de microfluidos y la configuración de los experimentos de microfluidos para medir la vida útil y los fenotipos celulares de células de levadura individuales.

El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Investigación

Biología

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

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RNAi de detección para identificar fenotipos postembrionarios en C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

Derribo Gene a gran escala en<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizar bibliotecas de alimentación de dsRNA para generar sólidas fenotipos de pérdida de función

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Florecimiento extracción de proteínas de levadura y purificación para el Estudio de la función, las interacciones y modificaciones post-traduccionales

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Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

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Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Análisis espacio-temporal de cytokinetic Eventos en la levadura de fisión

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

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