Name: the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of a ÃŽÂ²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions at JoVE.com

يعترف أصحاب المنطقة الفالونية لبلجيكا في إطار مشاريع البحوث سينسوتيم ونانوتيك وكذلك الوطنية الأموال للبحث العلمي (F.R.S.-F.N.R.S) لتقديم الدعم المالي.

1-إعداد نموذج البروتين
<ol><li>إنتاج وتنقية البروتين الهجين بلاب-كاب-Lys3 كما ورد في أعمالنا السابقة الدراسة15. تخزين البروتين في 50 ملم الفوسفات المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني 7.4 على النحو التالي: 8 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.2 جم من بوكل، ز 1.44 غ2هبو4 و 0.24 ز خ2بو4...

<ol>
	<li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors.">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li><li>Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+sensors:+principles,+problems+and+potential+for+detection+of+pathogens+and+associated+toxins.">Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins.</a> Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).</li><li>Huston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+antibody+binding+sites:+recovery+of+specific+activity+in+an+anti-digoxin+single-chain+Fv+analogue+produced+in+Escherichia+coli.">Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).</li><li>Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+a+single-chain+Fv+antibody+for+specific+detection+of+Bacillus+anthracis+spores.">Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Sheriff, S., Constantine, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+minimal+antigen-binding+fragment.">Redefining the minimal antigen-binding fragment.</a> Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+conserved+cryptic+epitopes+of+infectious+agents+by+single+domain+antibodies.+African+trypanosomes+as+paradigm.">Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm.</a> J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).</li><li>Thanongsaksrikul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+V+H+H+that+neutralizes+the+zinc+metalloproteinase+activity+of+botulinum+neurotoxin+type+A.">A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A.</a> J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+antigen+immunosensing+based+on+mixed+self-assembled+monolayers,+camel+antibodies+and+colloidal+gold+enhanced+sandwich+assays.">Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).</li><li>Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+beta-lactamase+in+enzyme+immunoassays+for+detection+of+microbial+antigens.">The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens.</a> J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).</li><li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+circularly+permutated+beta-lactamase+tethered+to+antibody+domains+by+specific+small+molecules.">Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules.</a> Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).</li><li>Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+Ligand-Dependent+Enzyme+by+Fusing+Circularly+Permuted+Antibody+Variable+Region+Domains.">Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains.</a> Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).</li><li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+licheniformis+BlaP+beta-lactamase+as+a+model+protein+scaffold+to+study+the+insertion+of+protein+fragments.">The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments.</a> Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).</li><li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+easy+development+of+versatile+tools+to+study+protein/ligand+interactions.">Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions.</a> Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).</li><li>Crasson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+functionalization+of+a+nanobody+using+protein+insertion+technology.">Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology.</a> Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).</li><li>Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+probe+electrochemically+active+material+state+in+portable+sensor+applications.">A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).</li><li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test,+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae.">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li><li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline.">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li><li>Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalization+of+porous+polypropylene+membranes+with+polyaniline+for+protein+immobilization.">Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization.</a> Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).</li><li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase.">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li><li>Worn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors.">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).</li><li>Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+allosteric+protein+switches+by+domain+insertion.">Engineering allosteric protein switches by domain insertion.</a> Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).</li><li>Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+protein+switches+based+on+an+ensemble+model+of+allostery.">Design of protein switches based on an ensemble model of allostery.</a> Nat Commun. 6, 6968 (2015).</li><li>Collinet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+accepted+insertions+of+proteins+within+protein+domains.">Functionally accepted insertions of proteins within protein domains.</a> J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).</li><li>Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+bifunctional+protein+by+insertion+of+beta-lactamase+into+the+maltodextrin-binding+protein.">Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein.</a> Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).</li><li>Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+Bacillus+hybrid+enzyme+GluXyn-1:+native-like+jellyroll+fold+preserved+after+insertion+of+autonomous+globular+domain.">Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).</li><li>Ruth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+for+the+priming+of+neutralizing+antibodies+against+non-immunogenic+STa+enterotoxin+from+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).</li><li>Zervosen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cattle+serum+antibody+responses+against+TEM+beta-lactamase+and+the+nonimmunogenic+Escherichia+coli+heat-stable+enterotoxin+(STaI).">Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI).</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).</li><li>Chevigne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bifunctional+hybrid+beta-lactamases+for+epitope+mapping+and+immunoassay+development.">Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development.</a> J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).</li><li>Ke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+engineered+beta-lactamase+maltose+binding+protein+fusion+protein:+insights+into+heterotropic+allosteric+regulation.">Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation.</a> PloS One. 7, 39168 (2012).</li><li>Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+urea+biosensor+based+on+an+immobilised+fullerene-urease+bio-conjugate.">Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate.</a> Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).</li><li>D'Orazio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+in+clinical+chemistry.">Biosensors in clinical chemistry.</a> Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).</li><li>Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+enzyme+immunoassay+using+miniaturized+anion-selective+electrodes+for+detection.">Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection.</a> Analyst. 134, 1601-1607 (2009).</li><li>Ding, J., Wang, X., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+galvanostatic+control+of+a+polymeric+membrane+ion-selective+electrode+for+potentiometric+immunoassays.">Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymeric+liquid+membrane+electrode+responsive+to+3,3',5,5'-tetramethylbenzidine+oxidation+for+sensitive+peroxidase/peroxidase+mimetic-based+potentiometric+biosensing.">A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing.</a> Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).</li><li>Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Biosensors+-+Sensor+Principles+and+Architectures.">Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures.</a> Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).</li><li>Bakker, E., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+potentiometry.">Nanoscale potentiometry.</a> Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).</li><li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection.">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li><li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications.">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).</li></ol>

في هذا العمل نقدم طريقة فونكتيوناليزي نانوبودي استخدام بلاب β-lactamase بروتين الناقل ونظهر أن يمكن أن ننفذ البروتين الهجين الناتجة بنجاح في مقايسة استشعار فرق الجهد. الجانب الابتكار الرئيسي لعملنا مقارنة بغيرها فحوصات بيوسينسور هو اقتران التساهمية الجزء الأجسام المضادة للنشاط الأنزيمي ال?...

أجهزة استشعار العوامل البيولوجية هي الأجهزة التحليلية التي تجمع تفاعل الحيوي جزيئي مع أجهزة إرسال الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية المشار إليها كمحولات الطاقة1. يمكن تفسير الإشارات المسجلة وتحويلها إلى رصد التفاعلات بين الشركاء المعطل تداولها ومجانا. معظم أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تنطوي على استخدام جسم مضاد للكشف عن تحليلها مثل الهرمونات أو علامات الممرض مختلفة2. تنسيقات استشعار مختلفة يمكن استخدامها، وتشمل هذه الأجهزة المستندة إلى كتلة أو مغناطيسية، بصرية أو الكهروكيميائية. هذه الأخيرة هي من بين الأكثر شيوعاً المستخدمة في أجهزة الاستشعار، وتعمل عن طريق تحويل حدث ملزم إلى إشارة كهربائية. الأداء والحساسيات جميع هذه الأجهزة المستندة إلى جسم تعتمد بشدة على أساسا معلمتين من معلمات: ط) نوعية الجسم والثاني) خصائص النظام المستخدمة لتوليد إشارة2.
الأجسام المضادة هي بروتينات dimeric كتلة عالية-الجزيئية (150 – 160 كاتشين) التي تتألف من اثنين من سلاسل ثقيلة واثنين من سلاسل خفيفة. واستقرت بالتفاعل بين السلاسل الخفيفة والثقيلة معظمها التفاعلات مسعور، فضلا عن سندات ثنائي كبريتيد مصانة. ويشمل كل سلسلة متغير مجال الذي يتفاعل مع مستضد أساسا عبر ثلاث مناطق هايبرفاريابل اسمه "مكملة تحديد المناطق" (CDR1-2-3). وعلى الرغم من العديد من التطورات في هذا المجال، التعبير على نطاق واسع من أجسام كاملة الطول مع أنظمة تعبير منخفضة التكلفة (مثل كولاي) غالباً ما يؤدي إلى إنتاج بروتينات غير مستقرة ومجمعة. وهذا السبب في مختلف أجزاء جسم قد تم إجراء هندسة عكسية مثل متغير واحد-سلسلة الأجزاء3 (سكففس ≈ كاتشين 25). وهي تتألف من مجالات متغير واحد على التوالي الثقيلة وسلاسل خفيفة واحدة مرتبطة تساهميا بتسلسل الأحماض الأمينية اصطناعية. بيد أن هذه الشظايا غالباً ما تعرض استقرار فقراء ولديهم ميل لتجميع، نظراً لأنها تعرض جزء كبير من مناطقها مسعور ل المذيبات4. وفي هذا السياق، يبدو أن سلسلة واحدة الكامليد جسم الشظايا، يشار إلى نانوبوديس أو فحص، بدائل ممتازة سكففس. تتوافق هذه المجالات إلى مجالات متغير من الأجسام المضادة أحادية السلسلة الكامليد. على النقيض من الأجسام المضادة التقليدية، الأجسام المضادة الكامليد تخلو من سلاسل خفيفة وتحتوي فقط على اثنين من سلاسل ثقيلة5. ولذلك، نانوبوديس هي أصغر جسم أحادي الأجزاء (12 كاتشين) قادرة على ربط مستضد مع تقارب مماثل للأجسام المضادة التقليدية6. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنها تعرض تحسين الاستقرار والقابلية للذوبان في مقارنة بغيرها طول الأجسام المضادة أو أجزاء جسم. أخيرا، أحجام صغيرة وعلى الحلقات CDR3 الموسعة يسمح لهم بالاعتراف بخفي [ابيتوبس] وربط إنزيم مواقع نشطة7،8. في الوقت الحاضر، هذه المجالات التي تحظى باهتمام كبير وتضافرت للتكنولوجيا بيوسينسور. على سبيل المثال، هوانغ وآخرون. وقد وضعت بيوسينسور على أساس نانوبودي للكشف والتحديد الكمي للبشرية مستضد البروستات محددة (PSA)9.
كما ذكر أعلاه، هو معياراً هاما في فحوصات biosensor كفاءة النظام المستخدمة لتوليد إشارة كهربائية. ولهذا السبب، المستندة إلى إنزيم أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية تجتذب اهتماما متزايداً، وقد استخدمت على نطاق واسع لمختلف التطبيقات مثل الرعاية الصحية والسلامة الغذائية، والرصد البيئي. أجهزة الاستشعار هذه تعتمد على التحلل الحفاز من الركازة بإنزيم لتوليد الإشارة الكهربائية. وفي هذا السياق، عرضت β-لاكتاماسيس أن تكون أكثر تحديداً، وأكثر حساسية وأسهل في التنفيذ تجريبيا من العديد من الإنزيمات الأخرى مثل الفوسفاتيز القلوية أو الفجل البيروكسيديز10. Β-lactamases هي الإنزيمات التي المسؤولة عن مقاومة الجراثيم للمضادات الحيوية بيتا لاكتام التي هيدروليزينج لهم. وهم أحادي، ومستقرة جداً، والكفاءة، وصغيرة الحجم. وعلاوة على ذلك، تولد الملاحق المجال/الببتيد إلى β-lactamases البروتينات تشيميريك ثنائية-الوظائف التي عرضت أن تكون أدوات فعالة لدراسة تفاعلات البروتين-يجند. في الواقع، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن إدراج أجزاء جسم متغير في نتائج β-lactamase TEM1 في بروتين تشيميريك التي ما زالت قادرة على ربط مع تقارب عالية على مستضد المستهدفة به. من المثير للاهتمام، والربط مستضد أبدى للحث على تنظيم نشاط الحفاز TEM111،12اللوستيريك. وعلاوة على ذلك، أظهرت أننا في العديد من الدراسات أن الإدراج المجال البروتين في حلقة متساهلة من Bacillus ليتشينيفورميس بلاب β-lactamase يولد البروتينات تشيميريك الوظيفية التي مناسبة تماما لرصد تفاعلات البروتين-يجند13 ،14. ونحن مؤخرا إدراج نانوبودي، اسمه كاب-Lys3، في هذا الموقع الإدراج المتساهلة بلاب15. وأبدى هذا نانوبودي لربط lysozyme الدجاجة-البيض-أبيض (هول) وكبح النشاط الأنزيمي16. لقد أظهرنا أن البروتين الهجين الذي تم إنشاؤه، اسمه بلاب-كاب-Lys3، الاحتفاظ خصوصية عالية/تقارب ضد هول بينما ظل النشاط β-lactamase بدون تغيير. ثم أننا بنجاح الجمع بين التكنولوجيا الهجينة β-lactamase إلى biosensor الكهروكيميائية وأظهر أنه يعتمد التفاعل بين بلاب-كاب-Lys3 وهول معطلة في قطب كمية الإشارات الكهربائية التي تم إنشاؤها. وفي الواقع، يدفع التحلل من المضادات الحيوية بيتا لاكتام بلاب بيان بروتون التي يمكن تحويلها إلى إشارة كهربائية كمية. هذا المزيج من التكنولوجيا الهجينة β-lactamase مع biosensor الكهروكيميائية سريعة وحساسة، الكمية، ويتيح قياس الإشارات التي تم إنشاؤها في الوقت الحقيقي. ويرد وصف هذه المنهجية هنا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1471">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:615px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>V000225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#8211;HCl</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alanine</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HClO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>34288</td>
			<td>1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>22090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzylpenicillin sodium</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>B0900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">hen egg white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">heptane</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>246654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>380539</td>
			<td>28% NH3&#160;in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657165</td>
			<td>CELLSTAR 6-Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>1AA110</td>
			<td>Lab pH meter inoLab pH 7110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vacuum and filtration system</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>NALG300-4100</td>
			<td>Filter holders with receiver, distributor : VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">potentiometric sensor chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGSTAT30 Autolab</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital multimeter, METRAHit 22M</td>
			<td>Gossen Metrawatt</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, successor Metrahit Base</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions

أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تزداد أهمية وتنفيذها في مختلف الميادين مثل الكشف عن مسببات المرض والتشخيص الجزيئي، والرصد البيئي، ومراقبة سلامة الأغذية. وفي هذا السياق، استخدمنا lactamases بيتا كمراسل كفاءة الإنزيمات في عدة دراسات التفاعل البروتين-بروتين. وعلاوة على ذلك، تشجع قدرتها على قبول الملاحق من الببتيدات أو منظم البروتينات/المجالات بشدة استخدام هذه الإنزيمات لتوليد بروتينات تشيميريك. في دراسة أجريت مؤخرا، ونحن إدراج جزء من جسم مجال واحد في بلاب Bacillus ليتشينيفورميس β-lactamase. يتم تعريف هذه المجالات الصغيرة، وتسمى أيضا نانوبوديس، كنطاقات مستضد ملزمة للأجسام المضادة واحد في سلسلة من الإبليات. وتظهر مثل الأجسام المضادة المشتركة لسلسلة مزدوجة، الانتماءات عالية والخصوصيات لأهدافها. معارضها البروتين تشيميريك الناتجة من تقارب عالية ضد هدفه مع الاحتفاظ بالنشاط β-lactamase. وهذا يوحي أن تظل مويتيس نانوبودي و β-lactamase الوظيفية. في هذا العمل، نحن تقرير بروتوكول مفصل الذي يجمع بين نظامنا β-lactamase الهجين للتكنولوجيا بيوسينسور. ويمكن الكشف عن ملزمة محددة من نانوبودي إلى هدفها بفضل مقياس كوندوكتيميتريك للبروتونات الصادرة عن نشاط الإنزيم الحفاز.

التصميم والهندسة للبروتين تشيميريك بلاب-كاب-Lys3
ويمثل الرقم 1 إدراج Lys3 سيارة الأجرة في حلقة متساهلة من الفئة أ بالب β-lactamase من Bacillus ليتشينيفورميس. وأجرى الإدراج بين بقايا Asp198 و Lys199. وعرض موقع انقسام ثرومبين على كل جانب من Lys3 سيارة أجرة. ا?...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of a ÃŽÂ²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions at JoVE.com

The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

في هذا العمل، نحن تقرير أسلوب جديد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين استخدام بيوسينسور كوندوكتيميتريك على أساس تكنولوجيا β-lactamase الهجين. ويعتمد هذا الأسلوب على الإفراج عن البروتونات عند التحلل من β-لاكتامس.

استخدام الإنزيم بيوسينسور كوندوكتيميتريك β-lactamase المستندة إلى الكشف عن التفاعلات الجزيئية البيولوجية

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

أسطح Micropatterned لدراسة التفاعلات حمض الهيالورونيك مع خلايا السرطان

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

اكتشاف الجزيئية البيولوجية توظيف الانعكاس التداخل التصوير الاستشعار (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; الإنسان المشيمة الإرواء الموديل

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

استخدام إنتاجية عالية<em&gt; في المختبر</em&gt; نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Use of a Rat Model to Study Ventral Abdominal Hernia Repair

استخدام نموذج الفئران لدراسة إصلاح الفتق البطني البطني

Ventral abdominal hernia is a relatively common clinical condition that sometimes requires herniorraphy (surgical repair). The repair of ventral abdominal ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

بيب على رقاقة: دراسة خالية من التسمية من التفاعلات البروتين فسفوانوسيتيد

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

الفيلم الجافة على أساس مقاوم الضوء Biosensor موائع جزيئية الكهروكيميائية منصة: تصنيع الجهاز وإعداد مقايسة على شريحة، ونظام التشغيل

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

تطوير Biosensor الكهروكيميائية الحمض النووي للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...