Name: the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of a ÃŽÂ²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions at JoVE.com

De auteurs erkennen het Waals Gewest in het kader van de onderzoeksprojecten SENSOTEM en NANOTIC alsmede de nationale middelen voor het wetenschappelijk onderzoek (FRS-F.N.R.S) voor hun financiële steun.

1. bereiding van de monsters eiwitten
<ol><li>Produceren en te zuiveren van de hybride proteïne BlaP-cAb-Lys3 zoals gemeld in onze vorige studie15. Bewaar het eiwit in 50 mM fosfaatbuffer pH 7.4 met de volgende samenstelling: 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1,44 g nb2HPO4 en 0,24 g. van KH2PO4 opgelost in 800 mL gedestilleerd water Fix de pH van de oplossing aan 7.4 vóór aanpassing van het uiteindelijke volume van de oplossing op 1 steriliseren L. Filter de ei...

<ol>
	<li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors.">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li><li>Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+sensors:+principles,+problems+and+potential+for+detection+of+pathogens+and+associated+toxins.">Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins.</a> Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).</li><li>Huston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+antibody+binding+sites:+recovery+of+specific+activity+in+an+anti-digoxin+single-chain+Fv+analogue+produced+in+Escherichia+coli.">Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).</li><li>Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+a+single-chain+Fv+antibody+for+specific+detection+of+Bacillus+anthracis+spores.">Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Sheriff, S., Constantine, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+minimal+antigen-binding+fragment.">Redefining the minimal antigen-binding fragment.</a> Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+conserved+cryptic+epitopes+of+infectious+agents+by+single+domain+antibodies.+African+trypanosomes+as+paradigm.">Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm.</a> J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).</li><li>Thanongsaksrikul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+V+H+H+that+neutralizes+the+zinc+metalloproteinase+activity+of+botulinum+neurotoxin+type+A.">A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A.</a> J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+antigen+immunosensing+based+on+mixed+self-assembled+monolayers,+camel+antibodies+and+colloidal+gold+enhanced+sandwich+assays.">Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).</li><li>Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+beta-lactamase+in+enzyme+immunoassays+for+detection+of+microbial+antigens.">The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens.</a> J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).</li><li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+circularly+permutated+beta-lactamase+tethered+to+antibody+domains+by+specific+small+molecules.">Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules.</a> Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).</li><li>Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+Ligand-Dependent+Enzyme+by+Fusing+Circularly+Permuted+Antibody+Variable+Region+Domains.">Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains.</a> Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).</li><li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+licheniformis+BlaP+beta-lactamase+as+a+model+protein+scaffold+to+study+the+insertion+of+protein+fragments.">The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments.</a> Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).</li><li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+easy+development+of+versatile+tools+to+study+protein/ligand+interactions.">Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions.</a> Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).</li><li>Crasson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+functionalization+of+a+nanobody+using+protein+insertion+technology.">Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology.</a> Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).</li><li>Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+probe+electrochemically+active+material+state+in+portable+sensor+applications.">A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).</li><li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test,+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae.">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li><li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline.">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li><li>Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalization+of+porous+polypropylene+membranes+with+polyaniline+for+protein+immobilization.">Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization.</a> Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).</li><li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase.">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li><li>Worn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors.">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).</li><li>Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+allosteric+protein+switches+by+domain+insertion.">Engineering allosteric protein switches by domain insertion.</a> Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).</li><li>Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+protein+switches+based+on+an+ensemble+model+of+allostery.">Design of protein switches based on an ensemble model of allostery.</a> Nat Commun. 6, 6968 (2015).</li><li>Collinet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+accepted+insertions+of+proteins+within+protein+domains.">Functionally accepted insertions of proteins within protein domains.</a> J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).</li><li>Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+bifunctional+protein+by+insertion+of+beta-lactamase+into+the+maltodextrin-binding+protein.">Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein.</a> Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).</li><li>Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+Bacillus+hybrid+enzyme+GluXyn-1:+native-like+jellyroll+fold+preserved+after+insertion+of+autonomous+globular+domain.">Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).</li><li>Ruth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+for+the+priming+of+neutralizing+antibodies+against+non-immunogenic+STa+enterotoxin+from+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).</li><li>Zervosen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cattle+serum+antibody+responses+against+TEM+beta-lactamase+and+the+nonimmunogenic+Escherichia+coli+heat-stable+enterotoxin+(STaI).">Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI).</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).</li><li>Chevigne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bifunctional+hybrid+beta-lactamases+for+epitope+mapping+and+immunoassay+development.">Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development.</a> J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).</li><li>Ke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+engineered+beta-lactamase+maltose+binding+protein+fusion+protein:+insights+into+heterotropic+allosteric+regulation.">Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation.</a> PloS One. 7, 39168 (2012).</li><li>Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+urea+biosensor+based+on+an+immobilised+fullerene-urease+bio-conjugate.">Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate.</a> Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).</li><li>D'Orazio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+in+clinical+chemistry.">Biosensors in clinical chemistry.</a> Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).</li><li>Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+enzyme+immunoassay+using+miniaturized+anion-selective+electrodes+for+detection.">Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection.</a> Analyst. 134, 1601-1607 (2009).</li><li>Ding, J., Wang, X., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+galvanostatic+control+of+a+polymeric+membrane+ion-selective+electrode+for+potentiometric+immunoassays.">Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymeric+liquid+membrane+electrode+responsive+to+3,3',5,5'-tetramethylbenzidine+oxidation+for+sensitive+peroxidase/peroxidase+mimetic-based+potentiometric+biosensing.">A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing.</a> Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).</li><li>Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Biosensors+-+Sensor+Principles+and+Architectures.">Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures.</a> Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).</li><li>Bakker, E., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+potentiometry.">Nanoscale potentiometry.</a> Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).</li><li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection.">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li><li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications.">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).</li></ol>

Hierbij presenteren we een methode om functionalize van een nanobody met behulp van de β-lactamase BlaP als een drager-eiwit en we laten zien dat we de daaruit resulterende eiwitten hybride met succes in een potentiometrische sensor assay implementeren kunt. De belangrijkste vernieuwing aspect van ons werk in vergelijking met andere biosensor testen is de covalente koppeling van het antilichaam deel naar de enzymatische activiteit het elektrische signaal genereert. Deze zogenaamde eiwit invoeging technology presenteert ...

Biosensoren zijn analytische apparaten die een bio-moleculaire interactie met fysische of chemische signalering apparaten die worden aangeduid als omvormers1combineren. De opgenomen signalen kunnen dan worden geïnterpreteerd en omgezet voor het controleren van de interacties tussen de geïmmobiliseerdet en gratis partners. Allermeest naar de biosensoren wordt gekenmerkt door het gebruik van een antilichaam te detecteren analyten zoals hormonen of andere ziekteverwekker markeringen2. Verschillende sensor indelingen kunnen worden gebruikt en massa-gebaseerde, magnetische, optische of elektrochemische biosensoren omvatten. De laatste behoren tot de meest gebruikte sensoren, en werkt door het omzetten van een bindende evenement in een elektrisch signaal. De voorstellingen en de gevoeligheden van alle antilichamen gebaseerde biosensoren zijn sterk afhankelijk van in wezen twee parameters: i) de kwaliteit van het antilichaam en ii) de eigenschappen van het systeem dat wordt gebruikt voor het genereren van het signaal-2.
Antilichamen zijn hoge-moleculaire massa dimeric eiwitten (150 – 160 kDa) dat uit twee zware kettingen en twee lichte kettingen bestaat. De interactie tussen de lichte en zware kettingen is meestal gestabiliseerd door hydrofobe interacties, alsmede een geconserveerde Zwavelbrug. Elke keten een variabele domein bevat dat met het antigeen in wezen via drie hypervariable regio's met de naam aanvullende bepaling van regio's (CDR1-2-3 samenwerkt). Ondanks de vele ontwikkelingen op het gebied, de grootschalige uitdrukking van full-length antilichamen met goedkope expressiesystemen (bijvoorbeeld E. coli) leidt vaak tot de productie van instabiele en geaggregeerde eiwitten. Dit is de reden waarom diverse fragmenten van antilichaam hebben ontworpen, zoals één-keten variabele fragmenten3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Zij bestaan uit de veranderlijke domeinen van respectievelijk één zware en een lichte kettingen die covalent gekoppeld zijn door een reeks synthetische aminozuur. Echter deze fragmenten vaak weer een slechte stabiliteit en hebben de neiging om statistische, aangezien zij een groot deel van hun hydrofobe regio's het oplosmiddel4blootstellen. In dit verband één keten kameelachtige antilichaam fragmenten, hierna nanobodies of VHHs, lijken te zijn uitstekende alternatieven voor ScFvs. Deze domeinen komen overeen met de variabele domeinen van kameelachtige single-keten antilichamen. In tegenstelling tot conventionele antilichamen, kameelachtige antilichamen zijn verstoken van lichte kettingen en alleen bevatten twee zware kettingen5. Daarom zijn nanobodies de kleinste monomeer antilichaam fragmenten (12 kDa) kunnen binden aan een antigeen met een vergelijkbaar met die van conventionele antilichamen6affiniteit. Bovendien, bieden ze verbeterde stabiliteit en oplosbaarheid in vergelijking met andere full-length antilichamen of fragmenten van antilichaam. Ten slotte, hun kleine maten en hun uitgebreide CDR3 loops laten herkennen cryptische epitopes en een binding met het enzym actieve sites7,8. Tegenwoordig, deze domeinen zijn veel aandacht krijgt en aan de biosensor technologie zijn gecombineerd. Bijvoorbeeld, Huang et al.. hebben ontwikkeld een nanobody gebaseerde biosensor voor de detectie en kwantificering van menselijke prostaat-specifiek antigen (PSA)9.
Zoals vermeld hierboven is een belangrijke parameter in biosensor testen de efficiëntie van het systeem gebruikt voor het genereren van het elektrische signaal. Om deze reden, enzym gebaseerde elektrochemische biosensoren steeds aandacht hebben getrokken en hebben grote schaal gebruikt voor diverse toepassingen zoals gezondheidszorg, voedselveiligheid en milieubewaking. Deze biosensoren vertrouwen op de katalytische hydrolyse van een substraat door een enzym voor het genereren van het elektrische signaal. In dit verband werden β-lactamases meer specifieke, gevoeliger en gemakkelijker te implementeren dan vele andere enzymen zoals alkalisch fosfatase of horseradish peroxidase10experimenteel aangetoond. Β-lactamases zijn enzymen die verantwoordelijk voor bacteriële resistentie tegen β-lactam antibiotica zijn door hydrolyseerd hen. Ze zijn monomeer, zeer stabiel, efficiënt, en van klein formaat. Domein/peptide invoegingen in β-lactamases genereren bovendien, bi-functionele chimeer eiwitten die te zien waren als efficiënte tools aan studie eiwit-ligand interacties. Inderdaad, recente studies hebben aangetoond dat het invoegen van variabele fragmenten van antilichaam in de TEM1 β-lactamase resultaten in een chimeer eiwit dat blijft kunnen binden met hoge affiniteit aan haar doel-antigeen. Interessant, bleek de antigeen-bindende ertoe allosteric verordening van11,12van de katalytische activiteit van de TEM1. Bovendien toonden we in verschillende studies dat eiwit domein inbrengen in een tolerante lus van de Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase functionele chimeer proteïnen toe die geschikt zijn produceert voor het controleren van de eiwit-ligand interacties13 ,14. We onlangs een nanobody, met de naam cAb-Lys3, in deze site tolerante invoeging van BlaP15ingevoegd. Deze nanobody werd getoond om te binden aan de kip-ei-wit lysozym (HEWL) en voor de remming van de enzymatische activiteit16. We toonden dat de gegenereerde hybride eiwit, genaamd BlaP-cAb-Lys3, een hoge specificiteit behouden / affiniteit tegen HEWL terwijl de β-lactamase activiteit bleef ongewijzigd. Dan zijn we met succes de hybride β-lactamase technologie om een elektrochemische biosensor gecombineerd en toonde aan dat de hoeveelheid gegenereerde elektrische signaal afhankelijk van de interactie tussen BlaP-cAb-Lys3 en HEWL op een elektrode geïmmobiliseerd was. Inderdaad, hydrolyse van β-lactam antibiotica door BlaP induceert een proton-release die kan worden omgezet in een kwantitatieve elektrisch signaal. Deze combinatie van de hybride β-lactamase technologie met een elektrochemische biosensor is snel, gevoelige, kwantitatieve en kunt real-time meting van het gegenereerde signaal. Deze methodologie wordt hierin beschreven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1471">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:615px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>V000225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#8211;HCl</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alanine</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HClO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>34288</td>
			<td>1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>22090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzylpenicillin sodium</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>B0900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">hen egg white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">heptane</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>246654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>380539</td>
			<td>28% NH3&#160;in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657165</td>
			<td>CELLSTAR 6-Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>1AA110</td>
			<td>Lab pH meter inoLab pH 7110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vacuum and filtration system</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>NALG300-4100</td>
			<td>Filter holders with receiver, distributor : VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">potentiometric sensor chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGSTAT30 Autolab</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital multimeter, METRAHit 22M</td>
			<td>Gossen Metrawatt</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, successor Metrahit Base</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions

Biosensoren zijn steeds belangrijk en toegepast op verschillende gebieden zoals pathogen detectie, moleculaire diagnostiek, milieumonitoring en veiligheid controle op levensmiddelen. In dit verband, we gebruikten β-lactamases als efficiënte verslaggever enzymen in verschillende eiwit-eiwit interactie studies. Bovendien is hun vermogen om te aanvaarden sterk inlassingen uit peptiden of gestructureerde eiwitten/domeinen stimuleert het gebruik van deze enzymen te genereren chimeer eiwitten. In een recente studie, wij in de Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase een enkel domein antilichamen-fragment ingevoegd. Deze kleine domeinen, een afkorting voor nanobodies, worden gedefinieerd als de antigeen-bindende domeinen van één keten antilichamen van kameelachtigen. Als gemeenschappelijke dubbele keten antilichamen tonen ze hoog affiniteiten en specifieke kenmerken van hun doelstellingen. De daaruit resulterende chimeer eiwitten tentoongesteld een hoge affiniteit tegen haar doelstelling met behoud van de β-lactamase activiteit. Dit suggereert dat de nanobody en β-lactamase wordt blijven functioneren. In het huidige werk rapporteren we een gedetailleerd protocol dat β-lactamase onze hybridesysteem aan de biosensor technologie combineert. De specifieke binding van de nanobody aan zijn doel kan worden opgespoord dankzij een conductimetric meting van de protonen uitgebracht door de katalytische activiteit van het enzym.

Design en engineering van het chimeer eiwit BlaP-cAb-Lys3
Figuur 1 geeft het inbrengen van cAb-Lys3 in een tolerante lus van de BalP klasse A β-lactamase van Bacillus licheniformis. De invoegpositie werd uitgevoerd tussen residuen van Asp198 en Lys199. Een trombine breukzijde geïntroduceerd aan weerskanten van cAb-Lys3. Cellen getransformeerd met een constitutief expressie plasmide codering het chimeer BlaP-cAb-Lys3-eiwi...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of a ÃŽÂ²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions at JoVE.com

The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In dit werk rapporteren we een nieuwe methode om te studeren met behulp van een conductimetric biosensor gebaseerd op de technologie van de β-lactamase hybride eiwit-eiwitinteractie. Deze methode is gebaseerd op de release van protonen op hydrolyse van β-lactamen.

Het gebruik van een β-lactamase gebaseerde Conductimetric Biosensor Assay voor het detecteren van biomoleculaire interacties

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Oppervlakken aan hyaluronzuur Interacties met kanker cellen te bestuderen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusie Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Gebruik van Label-free Optische biosensoren om Modulatie van kaliumkanalen Detect door G-proteïne gekoppelde receptoren

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Use of a Rat Model to Study Ventral Abdominal Hernia Repair

Gebruik van het Model van een Rat te bestuderen van de ventrale buik Hernia reparatie

Ventral abdominal hernia is a relatively common clinical condition that sometimes requires herniorraphy (surgical repair). The repair of ventral abdominal ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Ontwikkeling van een elektrochemische DNA Biosensor te detecteren een Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...