Name: the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of a ÃŽÂ²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions at JoVE.com

Les auteurs reconnaissent la région wallonne dans le cadre des projets de recherche SENSOTEM et NANOTIC, ainsi que le National fonds pour la recherche scientifique (F.R.S-F.N.R.S) pour leur soutien financier.

1. protein préparation des échantillons
<ol><li>Produire et purifier la protéine hybride BlaP-cAb-Lys3 comme indiqué dans notre précédente étude15. Stocker la protéine en 50 mM tampon phosphate pH 7.4 composée comme suit : 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 et 0,24 g de KH2PO4 dissous dans 800 mL d’eau distillée Difficulté le pH de la solution à 7,4 avant réglage du volume final de la solution à 1 L. filtre stériliser la sol...

<ol>
	<li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors.">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li><li>Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+sensors:+principles,+problems+and+potential+for+detection+of+pathogens+and+associated+toxins.">Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins.</a> Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).</li><li>Huston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+antibody+binding+sites:+recovery+of+specific+activity+in+an+anti-digoxin+single-chain+Fv+analogue+produced+in+Escherichia+coli.">Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).</li><li>Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+a+single-chain+Fv+antibody+for+specific+detection+of+Bacillus+anthracis+spores.">Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Sheriff, S., Constantine, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+minimal+antigen-binding+fragment.">Redefining the minimal antigen-binding fragment.</a> Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+conserved+cryptic+epitopes+of+infectious+agents+by+single+domain+antibodies.+African+trypanosomes+as+paradigm.">Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm.</a> J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).</li><li>Thanongsaksrikul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+V+H+H+that+neutralizes+the+zinc+metalloproteinase+activity+of+botulinum+neurotoxin+type+A.">A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A.</a> J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+antigen+immunosensing+based+on+mixed+self-assembled+monolayers,+camel+antibodies+and+colloidal+gold+enhanced+sandwich+assays.">Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).</li><li>Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+beta-lactamase+in+enzyme+immunoassays+for+detection+of+microbial+antigens.">The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens.</a> J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).</li><li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+circularly+permutated+beta-lactamase+tethered+to+antibody+domains+by+specific+small+molecules.">Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules.</a> Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).</li><li>Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+Ligand-Dependent+Enzyme+by+Fusing+Circularly+Permuted+Antibody+Variable+Region+Domains.">Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains.</a> Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).</li><li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+licheniformis+BlaP+beta-lactamase+as+a+model+protein+scaffold+to+study+the+insertion+of+protein+fragments.">The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments.</a> Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).</li><li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+easy+development+of+versatile+tools+to+study+protein/ligand+interactions.">Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions.</a> Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).</li><li>Crasson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+functionalization+of+a+nanobody+using+protein+insertion+technology.">Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology.</a> Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).</li><li>Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+probe+electrochemically+active+material+state+in+portable+sensor+applications.">A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).</li><li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test,+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae.">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li><li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline.">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li><li>Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalization+of+porous+polypropylene+membranes+with+polyaniline+for+protein+immobilization.">Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization.</a> Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).</li><li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase.">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li><li>Worn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors.">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).</li><li>Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+allosteric+protein+switches+by+domain+insertion.">Engineering allosteric protein switches by domain insertion.</a> Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).</li><li>Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+protein+switches+based+on+an+ensemble+model+of+allostery.">Design of protein switches based on an ensemble model of allostery.</a> Nat Commun. 6, 6968 (2015).</li><li>Collinet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+accepted+insertions+of+proteins+within+protein+domains.">Functionally accepted insertions of proteins within protein domains.</a> J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).</li><li>Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+bifunctional+protein+by+insertion+of+beta-lactamase+into+the+maltodextrin-binding+protein.">Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein.</a> Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).</li><li>Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+Bacillus+hybrid+enzyme+GluXyn-1:+native-like+jellyroll+fold+preserved+after+insertion+of+autonomous+globular+domain.">Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).</li><li>Ruth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+for+the+priming+of+neutralizing+antibodies+against+non-immunogenic+STa+enterotoxin+from+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).</li><li>Zervosen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cattle+serum+antibody+responses+against+TEM+beta-lactamase+and+the+nonimmunogenic+Escherichia+coli+heat-stable+enterotoxin+(STaI).">Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI).</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).</li><li>Chevigne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bifunctional+hybrid+beta-lactamases+for+epitope+mapping+and+immunoassay+development.">Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development.</a> J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).</li><li>Ke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+engineered+beta-lactamase+maltose+binding+protein+fusion+protein:+insights+into+heterotropic+allosteric+regulation.">Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation.</a> PloS One. 7, 39168 (2012).</li><li>Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+urea+biosensor+based+on+an+immobilised+fullerene-urease+bio-conjugate.">Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate.</a> Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).</li><li>D'Orazio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+in+clinical+chemistry.">Biosensors in clinical chemistry.</a> Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).</li><li>Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+enzyme+immunoassay+using+miniaturized+anion-selective+electrodes+for+detection.">Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection.</a> Analyst. 134, 1601-1607 (2009).</li><li>Ding, J., Wang, X., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+galvanostatic+control+of+a+polymeric+membrane+ion-selective+electrode+for+potentiometric+immunoassays.">Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymeric+liquid+membrane+electrode+responsive+to+3,3',5,5'-tetramethylbenzidine+oxidation+for+sensitive+peroxidase/peroxidase+mimetic-based+potentiometric+biosensing.">A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing.</a> Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).</li><li>Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Biosensors+-+Sensor+Principles+and+Architectures.">Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures.</a> Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).</li><li>Bakker, E., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+potentiometry.">Nanoscale potentiometry.</a> Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).</li><li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection.">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li><li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications.">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).</li></ol>

Dans ce travail, nous présentons une méthode pour fonctionnaliser un nanobody à l’aide de la β-lactamase BlaP comme protéine porteuse et nous montrons que nous pouvons implémenter avec succès la protéine hybride résultant dans un essai de capteur potentiométrique. La principale innovation de notre travail par rapport aux autres tests biocapteur est le couplage covalent de la partie de l’anticorps à l’activité enzymatique qui génère le signal électrique. Cette technologie d’insertion dite protéine ...

Biocapteurs sont des dispositifs analytiques qui combinent une interaction biomoléculaire avec les dispositifs de signalisation physiques ou chimiques appelés transducteurs1. Les signaux enregistrés soient interprétés et convertis pour surveiller les interactions entre les partenaires immobilisées et libres. La plupart des biocapteurs impliquent l’utilisation d’un anticorps pour détecter les analytes tels que les hormones ou autre agent pathogène marqueurs2. Formats de capteur différent peuvent être utilisés et comprennent des biocapteurs basée sur la masse, magnétiques, optiques ou électrochimiques. Ces derniers sont parmi les plus couramment utilisé des détecteurs et fonctionnent en convertissant un événement de liaison en un signal électrique. Les interprétations et exécutions et les sensibilités de tous les dérivés des anticorps biocapteurs dépendent essentiellement de deux paramètres : i) la qualité de l’anticorps et ii) les propriétés du système utilisé pour générer le signal2.
Les anticorps sont des protéines dimères masse moléculaire élevé (150 – 160 kDa) qui sont composées de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères. L’interaction entre les chaînes légères et lourdes est surtout stabilisée par des interactions hydrophobes, mais aussi une liaison disulfure conservée. Chaque chaîne comporte un domaine variable qui interagit avec l’antigène essentiellement par l’intermédiaire de trois régions hypervariables nommé complémentaires détermination de régions (CDR1-2-3). Malgré les nombreuses avancées dans le domaine, l’expression à grande échelle des anticorps pleine longueur avec des systèmes d’expression peu coûteux (p. ex., e. coli) mène souvent à la production de protéines instables et agrégées. C’est pourquoi divers fragments d’anticorps ont été conçus comme des fragments de chaîne unique variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Ils sont constitués des domaines variables des lourds respectivement un et un seul chaînes légères qui sont liées de façon covalente par une séquence d’acides aminés synthétiques. Toutefois, ces fragments souvent affichent une faible stabilité et ont tendance à regrouper, car ils exposent une grande partie de leurs régions hydrophobes au solvant4. Dans ce contexte, camélidés fragments d’anticorps, appelés nanocorps ou HHV, semblent être d’excellentes alternatives à ScFvs. Ces domaines correspondent à des domaines variables des anticorps de chaîne unique de camélidés. Contrairement aux anticorps traditionnels, les anticorps de camélidés sont dépourvues de chaînes légères et ne contiennent que deux chaînes lourdes5. Par conséquent, les nanocorps sont les fragments anticorps monomère plus petits (12 kDa) capables de se lier à un antigène avec une affinité semblable à celle des anticorps traditionnels6. En outre, ils présentent une stabilité et une solubilité par rapport à d’autres anticorps pleine longueur ou des fragments d’anticorps. Enfin, leurs petites tailles et leurs longues boucles CDR3 laissez-les reconnaissent des épitopes cryptiques et lier à l’enzyme sites actifs7,8. De nos jours, ces domaines suscitent un intérêt considérable et ont été combinés à la technologie des biocapteurs. Par exemple, Huang et al. ont mis au point un biocapteur axée sur les nanobody pour la détection et la quantification de l’antigène prostatique spécifique (PSA) humaine9.
Comme mentionné ci-dessus, un paramètre important dans les essais de biocapteur est l’efficacité du système utilisé pour générer le signal électrique. Pour cette raison, les biocapteurs électrochimiques à base d’enzymes ont attiré une attention croissante et ont été largement utilisés pour diverses applications telles que les soins de santé, la sécurité alimentaire et surveillance de l’environnement. Ces biocapteurs s’appuient sur l’hydrolyse catalytique d’un substrat par une enzyme pour générer le signal électrique. Dans ce contexte, β-lactamases se sont révélés être plus précis, plus sensible et plus facile à mettre en œuvre expérimentalement que beaucoup d’autres enzymes comme la phosphatase alcaline ou la peroxydase de raifort10. Β-lactamases sont des enzymes qui sont responsables de la résistance bactérienne aux antibiotiques β-lactamines par hydrolyse d’eux. Ils sont des monomères, très stable, efficace et de petite taille. En outre, insertions de domaine/peptide dans les β-lactamases génèrent bifonctionnel protéines chimériques qui se sont avérés être des outils efficaces pour étudier les interactions de protéine-ligand. En effet, les études récentes ont montré qu’insertion de fragments d’anticorps variable dans les résultats de β-lactamase TEM1 dans une protéine chimérique qui reste capable de se lier avec une haute affinité pour l’antigène cible. Fait intéressant, la liaison de l’antigène a été montrée pour induire la régulation allostérique de TEM1 activité catalytique11,12. En outre, nous avons montré dans plusieurs études que l’insertion de domaine protéine dans une boucle permissive de la β-lactamase de BlaP Bacillus licheniformis génère fonctionnelles protéines chimériques qui conviennent bien à surveiller les interactions protéine-ligand13 ,,14. Nous avons récemment inséré un nanobody, nommé cAb-Lys3, dans ce site d’insertion permissive de BlaP15. Cette nanobody a été montré pour lier au lysozyme de blanc d’oeuf-poule (lysozyme) et d’inhiber son activité enzymatique16. Nous avons montré que la protéine hybride généré, nommée BlaP-cAb-Lys3, conservé une grande spécificité / affinité contre lysozyme tandis que l’activité de la β-lactamase est restée inchangée. Ensuite, nous avons réussi combinée à la technologie hybride de β-lactamase à un Biocapteur électrochimique et a montré que la quantité de signal électrique généré dépendait de l’interaction entre BlaP-cAb-Lys3 et lysozyme immobilisée sur une électrode. En effet, l’hydrolyse des β-lactamines par BlaP induit une libération de protons qui peut être convertie en un signal électrique quantitatif. Cette combinaison de la technologie hybride de β-lactamase avec un Biocapteur électrochimique est quantitative, sensible et rapide et permet de mesurer en temps réel du signal généré. Cette méthode est décrite dans les présentes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1471">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:615px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>V000225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#8211;HCl</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alanine</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HClO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>34288</td>
			<td>1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>22090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzylpenicillin sodium</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>B0900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">hen egg white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">heptane</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>246654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>380539</td>
			<td>28% NH3&#160;in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657165</td>
			<td>CELLSTAR 6-Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>1AA110</td>
			<td>Lab pH meter inoLab pH 7110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vacuum and filtration system</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>NALG300-4100</td>
			<td>Filter holders with receiver, distributor : VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">potentiometric sensor chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGSTAT30 Autolab</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital multimeter, METRAHit 22M</td>
			<td>Gossen Metrawatt</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, successor Metrahit Base</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions

Biocapteurs deviennent de plus en plus important et mis en œuvre dans différents domaines tels que la détection des pathogènes, diagnostic moléculaire, la surveillance environnementale et contrôle de sécurité des aliments. Dans ce contexte, nous avons utilisé des β-lactamases comme enzymes journaliste efficace dans plusieurs études sur les interactions protéine-protéine. En outre, leur capacité à accepter des insertions de peptides ou de protéines/domaines structurés fortement encourage l’utilisation de ces enzymes pour produire des protéines chimériques. Dans une étude récente, nous avons inséré un fragment d’anticorps à domaine unique dans la β-lactamase de Bacillus licheniformis BlaP. Ces petits domaines, également appelés nanocorps, sont définis comme le domaine de liaison antigène anticorps seule chaîne camélidés. Comme les anticorps double chaîne commune, ils montrent des affinités élevées et les spécificités de leurs cibles. La protéine chimérique qui en résulte ont montré une grande affinité contre sa cible tout en conservant l’activité β-lactamase. Ceci suggère que les fractions nanobody et β-lactamases restent fonctionnelles. Dans le présent travail, nous présentons un protocole détaillé qui combine notre système de β-lactamase hybride à la technologie des biocapteurs. La fixation spécifique de la nanobody vers sa cible peut être détectée grâce à une mesure conductimétrique des protons libérés par l’activité catalytique de l’enzyme.

Conception et l’ingénierie des protéines chimériques BlaP-cAb-Lys3
La figure 1 représente l’insertion du cAb-Lys3 dans une boucle permissive de la β-lactamases de classe A BalP Bacilluslicheniformis. L’insertion a été effectuée entre les résidus Asp198 et Lys199. Un site de clivage de la thrombine a été introduit sur chaque côté du cAb-Lys3. Cellules transformés avec un expression constitutive de plasmi...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of a ÃŽÂ²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions at JoVE.com

The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Dans ce travail, nous présentons une nouvelle méthode pour étudier les interactions de protéine-protéine à l’aide d’un biocapteur conductimétrique basé sur la technologie de β-lactamase hybride. Cette méthode repose sur la libération de protons par hydrolyse des β-lactames.

L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Surfaces Micropatterned pour étudier les interactions acide hyaluronique avec les cellules cancéreuses

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Recherche

Bio-ingénierie

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Détection biomoléculaire employant le capteur interférométrique Réflectance Imaging (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l&#39;<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human perfusion placentaire modèle

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

L&#39;utilisation de biocapteurs optiques sans étiquette pour détecter la modulation de potassium par les canaux G récepteurs couplés aux protéines

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Utilisation d&#39;un haut-débit<em&gt; In Vitro</em&gt; Système microfluidique pour développer orales biofilms multi-espèces

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Use of a Rat Model to Study Ventral Abdominal Hernia Repair

Utilisation d’un modèle de Rat pour étudier une hernie abdominale ventrale

Ventral abdominal hernia is a relatively common clinical condition that sometimes requires herniorraphy (surgical repair). The repair of ventral abdominal ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: une étude sans étiquette des interactions protéines-phosphoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...