Name: the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00
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लेखक बेल्जियम के Walloon क्षेत्र को SENSOTEM और NANOTIC अनुसंधान परियोजनाओं के ढांचे के भीतर स्वीकार करते हैं और साथ ही उनके वित्तीय सहायता के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान (F.R.S.-एफ. एन. आर. एस.) के लिए राष्ट्रीय कोष भी तैयार करते हैं.

1. प्रोटीन सैंपल की तैयारी
<ol><li>उत्पादन और संकर प्रोटीन BlaP-cAb-Lys3 के रूप में हमारे पिछले अध्ययन में बताया15शुद्ध । निंनलिखित संरचना के साथ ५० mM फॉस्फेट बफर पीएच ७.४ में प्रोटीन की दुकान: NaCl के 8 ग्राम, KCl क?...

<ol>
	<li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors.">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li><li>Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+sensors:+principles,+problems+and+potential+for+detection+of+pathogens+and+associated+toxins.">Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins.</a> Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).</li><li>Huston, J. 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इस काम में हम एक वाहक प्रोटीन के रूप में BlaP β-lactamase का उपयोग कर एक nanobody functionalize करने के लिए एक विधि वर्तमान और हम हम सफलतापूर्वक एक potentiometric संवेदक परख में परिणामी संकर प्रोटीन को लागू कर सकते हैं कि दिखा. हमारे काम क...

जैव संवेदी विश्लेषण उपकरण है कि भौतिक या रासायनिक संकेतन उपकरणों के साथ एक जैविक आणविक बातचीत गठबंधन कर रहे है ट्रांसड्यूसर1के रूप में भेजा. दर्ज संकेतों को फिर समझा जा सकता है और मैटीरियल और मुक्त भागीदारों के बीच बातचीत की निगरानी में परिवर्तित कर सकते हैं । इस तरह के हार्मोन या अलग रोगज़नक़ मार्करों2के रूप में analytes का पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग शामिल है । विभिंन सेंसर स्वरूपों का इस्तेमाल किया जा सकता है और शामिल जन आधारित, चुंबकीय, ऑप्टिकल या विद्युत बायोमास । बाद के सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेंसर के बीच में हैं, और एक बिजली के संकेत में एक बाध्यकारी घटना परिवर्तित करके कार्य करते हैं । प्रदर्शन और सभी एंटीबॉडी आधारित संवेदनशीलता का दृढ़ता से अनिवार्य रूप से दो मापदंडों पर निर्भर कर रहे हैं: i) एंटीबॉडी और द्वितीय की गुणवत्ता) प्रणाली के गुण के लिए संकेत उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया2।
एंटीबॉडी उच्च आणविक जन dimeric प्रोटीन (150-160 केडीए) है कि दो भारी चेन और दो प्रकाश श्रृंखला से बना रहे हैं । प्रकाश और भारी श्रृंखला के बीच बातचीत ज्यादातर hydrophobic बातचीत के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक संरक्षित डाइसल्फ़ाइड बांड द्वारा स्थिर है । प्रत्येक श्रृंखला एक चर डोमेन है कि प्रतिजन के साथ इंटरैक्ट करता है अनिवार्य रूप से तीन hypervariable पूरक निर्धारित क्षेत्रों (CDR1-2-3) नामित क्षेत्रों के माध्यम से शामिल है । क्षेत्र में कई अग्रिमों के बावजूद, कम लागत वाली अभिव्यक्ति प्रणालियों (जैसे, ई. कोलाई) के साथ पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी के बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति अक्सर अस्थिर और एकत्रित प्रोटीन के उत्पादन की ओर जाता है । यही कारण है कि विभिंन एंटीबॉडी टुकड़े इंजीनियर किया गया है जैसे एकल श्रृंखला चर टुकड़े3 (ScFvs ≈ 25 केडीए) । वे क्रमशः एक भारी और एक प्रकाश श्रृंखला है कि एक सिंथेटिक एमिनो एसिड अनुक्रम से जुड़े covalently है के चर डोमेन से मिलकर बनता है । हालांकि, इन टुकड़ों अक्सर एक गरीब स्थिरता प्रदर्शित करने और कुल करने की प्रवृत्ति है, क्योंकि वे अपने hydrophobic क्षेत्रों का एक बड़ा हिस्सा विलायक4को बेनकाब । इस संदर्भ में, एकल श्रृंखला camelid एंटीबॉडी टुकड़े, nanobodies या VHHs के रूप में संदर्भित, ScFvs के लिए उत्कृष्ट विकल्प प्रतीत होते हैं । इन डोमेन camelid एकल श्रृंखला एंटीबॉडी के चर डोमेन के अनुरूप हैं । पारंपरिक एंटीबॉडी के विपरीत, camelid एंटीबॉडी प्रकाश श्रृंखला से रहित हैं और केवल दो भारी चेन5होते हैं. इसलिए, nanobodies छोटे monomeric एंटीबॉडी टुकड़े (12 केडीए) एक प्रतिजन के लिए एक पारंपरिक एंटीबॉडी6के समान समानता के साथ बाइंड करने में सक्षम हैं । इसके अलावा, वे अंय पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़े की तुलना में सुधार स्थिरता और घुलनशीलता उपस्थित । अंत में, उनके छोटे आकार और उनके विस्तारित CDR3 छोरों उन्हें गुप्त epitopes पहचान करने के लिए और एंजाइम सक्रिय साइटों7करने के लिए बाइंड करने के लिए अनुमति देते हैं,8. आजकल, इन डोमेन काफी ध्यान प्राप्त कर रहे है और कर रहे है संयुक्त करने के लिए किया गया है । उदाहरण के लिए, हुआंग एट अल। ने मानव प्रोस्टेट-विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए)9का पता लगाने और ठहराव के लिए एक nanobody आधारित सी-सेंसर विकसित किया है ।
के रूप में उपर्युक्त, एक महत्वपूर्ण पैरामीटर में सेंसर परख है बिजली के संकेत उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली की क्षमता है । इस कारण से, एंजाइम आधारित विद्युत के लिए कभी आकर्षित किया है-बढ़ती ध्यान और विभिंन अनुप्रयोगों के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है जैसे स्वास्थ्य देखभाल, खाद्य सुरक्षा, और पर्यावरण की निगरानी । ये एक एंजाइम द्वारा एक सब्सट्रेट के उत्प्रेरक hydrolysis पर निर्भर बिजली के संकेत उत्पंन करने के लिए । इस संदर्भ में, β-लैक्टमेज़ अधिक विशिष्ट, अधिक संवेदनशील और क्षारीय फॉस्फेट या सहिजन peroxidase10जैसे कई अन्य एंजाइमों की तुलना में प्रयोग को लागू करने के लिए आसान होने के लिए दिखाया गया था । β-लैक्टमेज़ वे hydrolyzing द्वारा β-लस्टम एंटीबायोटिक दवाओं के जीवाणु प्रतिरोध के लिए जिंमेदार हैं कि एंजाइमों रहे हैं । वे monomeric, बहुत स्थिर, कुशल, और छोटे आकार के होते हैं । इसके अलावा, डोमेन/β-लैक्टमेज़ उत्पन्न द्वि-कार्यात्मक chimeric प्रोटीन है कि प्रोटीन-ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए कुशल उपकरण होने के लिए दिखाया गया है । वास्तव में, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्रविष्टि एंटीबॉडी चर टुकड़ों में TEM1 β-lactamase परिणाम में एक chimeric प्रोटीन है कि अपने लक्ष्य प्रतिजन के लिए उच्च समानता के साथ बाइंड करने में सक्षम रहता है । दिलचस्प है, प्रतिजन बाध्यकारी TEM1 उत्प्रेरक गतिविधि11,12के allosteric विनियमन प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था । इसके अलावा, हम कई अध्ययनों में पता चला है कि प्रोटीन डोमेन प्रविष्टि के एक स्वतंत्र पाश में बैसिलस licheniformis BlaP β-lactamase कार्यात्मक chimeric प्रोटीन है कि अच्छी तरह से प्रोटीन की निगरानी के लिए अनुकूल है-ligand बातचीत उत्पन्न करता है13 ,14. हम हाल ही में एक nanobody डाला, टैक्सी-Lys3 नाम, BlaP15के इस स्वतंत्र प्रविष्टि साइट में. इस nanobody को मुर्गी-अंडा-सफेद lysozyme (HEWL) से बाँध कर दिखाया गया और इसकी एंजाइमी गतिविधि को बाधित करने के लिए१६. हमने दिखाया है कि उत्पन्न संकर प्रोटीन, नाम BlaP-कैब-Lys3, HEWL के खिलाफ एक उच्च विशिष्टता/जब β-lactamase गतिविधि अपरिवर्तित बनी रहती है । तब हम सफलतापूर्वक एक विद्युत के लिए हाइब्रिड β-lactamase प्रौद्योगिकी संयुक्त सेंसर और पता चला कि उत्पन्न बिजली के संकेत की मात्रा BlaP-कैब के बीच बातचीत के निर्भर था-Lys3 और HEWL एक इलेक्ट्रोड पर मैटीरियल. दरअसल, BlaP द्वारा β-लस्टम एंटीबायोटिक दवाओं के hydrolysis एक प्रोटॉन रिलीज है कि एक मात्रात्मक बिजली के संकेत में परिवर्तित किया जा सकता है लाती है । एक विद्युत के साथ संकर β-lactamase प्रौद्योगिकी का यह संयोजन तेज, संवेदनशील, मात्रात्मक है, और उत्पन्न संकेत की वास्तविक समय माप की अनुमति देता है. यह कार्यप्रणाली यहां बताई गई है ।

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		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:615px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>V000225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#8211;HCl</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alanine</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HClO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>34288</td>
			<td>1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>22090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzylpenicillin sodium</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>B0900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">hen egg white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">heptane</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>246654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>380539</td>
			<td>28% NH3&#160;in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657165</td>
			<td>CELLSTAR 6-Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>1AA110</td>
			<td>Lab pH meter inoLab pH 7110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vacuum and filtration system</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>NALG300-4100</td>
			<td>Filter holders with receiver, distributor : VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">potentiometric sensor chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGSTAT30 Autolab</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital multimeter, METRAHit 22M</td>
			<td>Gossen Metrawatt</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, successor Metrahit Base</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions

ऐसे रोगजनकों का पता लगाने, आणविक निदान, पर्यावरणीय निगरानी और खाद्य सुरक्षा नियंत्रण के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में तेजी से महत्वपूर्ण और कार्यान्वित किया जा रहा है । इस संदर्भ में, हम कई प्रोटीन प्रोटीन इंटरेक्शन अध्ययन में कुशल रिपोर्टर एंजाइम के रूप में β-लैक्टमेज़ इस्तेमाल किया । इसके अलावा, उनके पेप्टाइड्स या संरचित प्रोटीन की संमिलन को स्वीकार करने की क्षमता/डोमेन दृढ़ता से इन एंजाइमों के उपयोग के लिए प्रोत्साहित chimeric प्रोटीन पैदा करते हैं । हाल ही के एक अध्ययन में, हम एक एकल-डोमेन एंटीबॉडी अंश को बैसिलस licheniformis BlaP β-lactamase में संमिलित किया । इन छोटे डोमेन, nanobodies भी कहा जाता है, camelids से एकल श्रृंखला एंटीबॉडी के प्रतिजन बंधन डोमेन के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । आम डबल चेन एंटीबॉडी की तरह, वे अपने लक्ष्य के लिए उच्च समानताएं और विशिष्टताओं को दिखाते हैं । परिणामस्वरूप chimeric प्रोटीन अपने लक्ष्य के खिलाफ एक उच्च समानता का प्रदर्शन करते हुए β-lactamase गतिविधि को बनाए रखने । यह सुझाव है कि nanobody और β-lactamase moieties कार्यात्मक रहते हैं । वर्तमान काम में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि हमारे संकर β-lactamase प्रणाली को जोड़ने के लिए की रिपोर्ट है । अपने लक्ष्य के लिए nanobody के विशिष्ट बंधन एंजाइम की उत्प्रेरक गतिविधि द्वारा जारी प्रोटॉन के एक conductimetric माप के लिए धन्यवाद का पता लगाया जा सकता है ।

डिजाइन और इंजीनियरिंग के chimeric प्रोटीन BlaP-कैब-Lys3
चित्रा 1 BalP वर्ग के एक स्वतंत्र लूप में cAb-Lys3 के सम्मिलन का प्रतिनिधित्व करता है a β-lactamase से बैसिलस licheniformis. संमिलन Asp198 और Lys199 अवशे...

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The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

इस काम में, हम हाइब्रिड β-lactamase तकनीक के आधार पर एक conductimetric का उपयोग करके प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक नई विधि की रिपोर्ट करते हैं. इस विधि β-lactams के hydrolysis पर प्रोटॉन की रिहाई पर निर्भर करता है ।

एक β-lactamase-आधारित Conductimetric के उपयोग के लिए गैर-आणविक बातचीत का पता लगाने के लिए परख

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

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Micropatterned सतहों Hyaluronic एसिड कैंसर कोशिकाओं के साथ संबंधों का अध्ययन करने के लिए

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

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Biomolecular interferometric reflectance इमेजिंग सेंसर (आईआरआईएस) रोजगार जांच

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

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जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स द्वारा पोटेशियम चैनलों की मॉड्यूलेशन का पता लगाने के लिए लेबल मुक्त ऑप्टिकल biosensors का प्रयोग करें

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

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एक उच्च throughput का प्रयोग करें<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Microfluidic प्रणाली ओरल बहु प्रजातियों Biofilms विकसित करने के लिए

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

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Ventral पेट हर्निया की मरंमत का अध्ययन करने के लिए एक चूहे मॉडल का उपयोग

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PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

पीआईपी-ऑन-ए-चिप: प्रोटीन-फॉस्फोइनॉसाइटिड इंटरैक्शन के लेबल-मुक्त अध्ययन

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

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सूखी फिल्म Photoresist-विद्युत Microfluidic आधारित सेंसर मंच: उपकरण निर्माण, पर चिप परख तैयारी, और सिस्टम ऑपरेशन

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

एक विद्युत डीएनए के विकास के लिए एक Foodborne रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सेंसर

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...