Name: the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00
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저자는 SENSOTEM 및 NANOTIC 연구 프로젝트의 프레임 워크 내에서 벨기에의 왈 롱 지역 뿐만 아니라 국가 자금에 대 한의 과학 연구 (F.R.S.-F.N.R.S) 그들의 재정 지원에 대 한 인정합니다.

1. 단백질 샘플 준비
<ol><li>고 정화 하이브리드 단백질 BlaP-택시-Lys3로 우리의 이전 연구15에 보고 합니다. 50 m m 인산 버퍼 pH 7.4 다음 구성에서에서 단백질을 저장: 8 g의 NaCl, KCl의 0.2 g, 나2HPO4 의 1.44 g, KH2포4 증류수 800 mL에 용 해의 0.24 g 수정 전에 7.4 해결책의 pH 1 솔루션의 최종 볼륨을 조정 L. 필터 단백질 해결책 소독.</li>
	<li>암 탉 달걀 흰 lysozyme...

<ol>
	<li>Higgins, I. J., Lowe, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+principles+and+applications+of+biosensors.">Introduction to the principles and applications of biosensors.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).</li><li>Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+sensors:+principles,+problems+and+potential+for+detection+of+pathogens+and+associated+toxins.">Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins.</a> Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).</li><li>Huston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+engineering+of+antibody+binding+sites:+recovery+of+specific+activity+in+an+anti-digoxin+single-chain+Fv+analogue+produced+in+Escherichia+coli.">Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).</li><li>Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+implementation+of+a+single-chain+Fv+antibody+for+specific+detection+of+Bacillus+anthracis+spores.">Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Sheriff, S., Constantine, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+minimal+antigen-binding+fragment.">Redefining the minimal antigen-binding fragment.</a> Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).</li><li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+conserved+cryptic+epitopes+of+infectious+agents+by+single+domain+antibodies.+African+trypanosomes+as+paradigm.">Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm.</a> J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).</li><li>Thanongsaksrikul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+V+H+H+that+neutralizes+the+zinc+metalloproteinase+activity+of+botulinum+neurotoxin+type+A.">A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A.</a> J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+antigen+immunosensing+based+on+mixed+self-assembled+monolayers,+camel+antibodies+and+colloidal+gold+enhanced+sandwich+assays.">Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).</li><li>Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+beta-lactamase+in+enzyme+immunoassays+for+detection+of+microbial+antigens.">The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens.</a> J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).</li><li>Kojima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+circularly+permutated+beta-lactamase+tethered+to+antibody+domains+by+specific+small+molecules.">Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules.</a> Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).</li><li>Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+Ligand-Dependent+Enzyme+by+Fusing+Circularly+Permuted+Antibody+Variable+Region+Domains.">Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains.</a> Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).</li><li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacillus+licheniformis+BlaP+beta-lactamase+as+a+model+protein+scaffold+to+study+the+insertion+of+protein+fragments.">The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments.</a> Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).</li><li>Vandevenne, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+easy+development+of+versatile+tools+to+study+protein/ligand+interactions.">Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions.</a> Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).</li><li>Crasson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+functionalization+of+a+nanobody+using+protein+insertion+technology.">Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology.</a> Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).</li><li>Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+probe+electrochemically+active+material+state+in+portable+sensor+applications.">A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).</li><li>Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+BYG+Carba+Test,+a+New+Electrochemical+Assay+for+Rapid+Laboratory+Detection+of+Carbapenemase-Producing+Enterobacteriaceae.">Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).</li><li>Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adsorption+under+electrical+stimulation+of+neural+probe+coated+with+polyaniline.">Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).</li><li>Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+functionalization+of+porous+polypropylene+membranes+with+polyaniline+for+protein+immobilization.">Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization.</a> Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).</li><li>Khatkhatay, M. I., Desai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+performances+of+four+enzymes+used+in+ELISA+with+special+reference+to+beta-lactamase.">A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase.</a> J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).</li><li>Worn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+in+vitro+stability+and+in+vivo+performance+of+anti-GCN4+intrabodies+as+cytoplasmic+inhibitors.">Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors.</a> J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).</li><li>Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+allosteric+protein+switches+by+domain+insertion.">Engineering allosteric protein switches by domain insertion.</a> Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).</li><li>Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+protein+switches+based+on+an+ensemble+model+of+allostery.">Design of protein switches based on an ensemble model of allostery.</a> Nat Commun. 6, 6968 (2015).</li><li>Collinet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+accepted+insertions+of+proteins+within+protein+domains.">Functionally accepted insertions of proteins within protein domains.</a> J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).</li><li>Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+a+bifunctional+protein+by+insertion+of+beta-lactamase+into+the+maltodextrin-binding+protein.">Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein.</a> Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).</li><li>Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+Bacillus+hybrid+enzyme+GluXyn-1:+native-like+jellyroll+fold+preserved+after+insertion+of+autonomous+globular+domain.">Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).</li><li>Ruth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+vaccination+for+the+priming+of+neutralizing+antibodies+against+non-immunogenic+STa+enterotoxin+from+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).</li><li>Zervosen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cattle+serum+antibody+responses+against+TEM+beta-lactamase+and+the+nonimmunogenic+Escherichia+coli+heat-stable+enterotoxin+(STaI).">Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI).</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).</li><li>Chevigne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bifunctional+hybrid+beta-lactamases+for+epitope+mapping+and+immunoassay+development.">Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development.</a> J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).</li><li>Ke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+engineered+beta-lactamase+maltose+binding+protein+fusion+protein:+insights+into+heterotropic+allosteric+regulation.">Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation.</a> PloS One. 7, 39168 (2012).</li><li>Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+urea+biosensor+based+on+an+immobilised+fullerene-urease+bio-conjugate.">Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate.</a> Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).</li><li>D'Orazio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+in+clinical+chemistry.">Biosensors in clinical chemistry.</a> Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).</li><li>Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+enzyme+immunoassay+using+miniaturized+anion-selective+electrodes+for+detection.">Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection.</a> Analyst. 134, 1601-1607 (2009).</li><li>Ding, J., Wang, X., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+galvanostatic+control+of+a+polymeric+membrane+ion-selective+electrode+for+potentiometric+immunoassays.">Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polymeric+liquid+membrane+electrode+responsive+to+3,3',5,5'-tetramethylbenzidine+oxidation+for+sensitive+peroxidase/peroxidase+mimetic-based+potentiometric+biosensing.">A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing.</a> Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).</li><li>Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemical+Biosensors+-+Sensor+Principles+and+Architectures.">Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures.</a> Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).</li><li>Bakker, E., Pretsch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+potentiometry.">Nanoscale potentiometry.</a> Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).</li><li>Zhang, D., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensors+and+bioelectronics+on+smartphone+for+portable+biochemical+detection.">Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection.</a> Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).</li><li>Nemiroski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+mobile+electrochemical+detector+designed+for+use+in+resource-limited+applications.">Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).</li></ol>

이 작품에서는 캐리어 단백질으로 BlaP β-lactamase를 사용 하 여 nanobody를 functionalize 하는 방법을 소개 하 고 우리는 우리가 성공적으로 구현할 수 결과 하이브리드 단백질 potentiometric 센서 분석 결과 보여. 다른 바이오 센서 분석 실험에 비해 우리의 작업의 주요 혁신 측면은 전기 신호를 생성 하는 효소 활동을 항 체 부분의 공유 결합. 이 소위 단백질 삽입 기술 선물 장점과 한계가이 섹션의 주요 초?...

바이오 센서는 바이오 분자 상호 변환기1이라고 하는 물리적 또는 화학적 신호 장치를 결합 하는 분석 장치. 기록 된 신호 다음 해석 하 고 고정 및 무료 파트너 간의 상호 작용을 모니터링 변환할 수 있습니다. 바이오 센서의 대부분은 호르몬 등 다른 병원 체 마커2analytes를 검출 하는 항 체의 사용을 포함. 다른 센서 형식을 사용할 수 있습니다 하 고 질량, 자석, 광학 또는 전기 화학 바이오 센서를 포함 합니다. 후자는 가장 일반적으로 사용 되는 센서, 그리고 바인딩 이벤트를 전기 신호로 변환 하 여 작동. 공연 및 모든 항 체 기반 바이오 센서의 감도 기본적으로 두 개의 매개 변수에 강하게 의존: i)는 항 체와 ii)2신호 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 속성의 품질.
항 체는 2 개의 무거운 사슬과 2 개의 가벼운 사슬 구성 높은 분자 질량 dimeric 단백질 (150-160 kDa). 빛과 무거운 사슬 사이 상호 작용은 주로 소수 성 상호 작용 보존된 이황화 결합에 의해 안정 된다. 각 체인에는 본질적으로 보완 결정 영역 (CDR1-2-3) 라는 3 하이퍼 영역을 통해 항 원와 상호 작용 하는 변수 도메인 포함 되어 있습니다. 필드, 낮은-비용 식 시스템 (예를 들면, 대장균) 전체 길이 항 체의 대규모 식에서에서 수많은 진보에도 불구 하 고 종종 불안정 하 고 집계 된 단백질의 생산에 지도 한다. 이 때문에 단일 체인 변수 조각3 (ScFvs ≈ 25 kDa)와 같은 다양 한 항 체 파편을 설계 되었습니다 있다. 그들은 각각 한 중 고 covalently는 합성 아미노산 서 열에 의해 연결 된 1 개의 경 쇄의 가변 도메인 구성 됩니다. 그러나,이 파편은 종종 가난한 안정성 표시 하 고 집계, 때문에 그들은 그들의 소수 성 영역 용4의 큰 부분을 노출 하는 경향이 있다. 이러한 맥락에서 단일 체인 camelid 항 체 단편, nanobodies 또는 VHHs, ScFvs에 대 한 우수한 대안을 것 같다. 이러한 도메인 camelid 단일 체인 항 체의 가변 도메인에 해당합니다. 기존의 항 체, 달리 camelid 항 체 경 쇄가 없는 고 두 무거운 체인5포함. 따라서, nanobodies는 가장 작은 단위체 항 체 파편 (12 kDa) 기존의 항 체6의 선호도와 항 원에 바인딩할 수 있습니다. 또한, 그들은 향상 된 안정성과 가용성 다른 전장 항 체 또는 항 체 파편에 비해 제시. 마지막으로, 그들의 작은 크기와 그들의 확장된 CDR3 루프 그들이 이상한 epitopes를 인식 하 고 효소 활성 사이트7,8바인딩할 수 있습니다. 요즘, 이러한 도메인 상당한 관심을 받고 있다 고 바이오 센서 기술에 결합 되었습니다. 예를 들어 황은 외. 탐지 및 정량화 인간 전립선 특정 항 원 (PSA)9의 nanobody 기반 바이오 센서를 개발 했습니다.
언급-위, 바이오 센서 분석에 중요 한 매개 변수는 전기 신호를 생성 하는 데 사용 하는 시스템의 효율성. 이러한 이유로, 효소 기반 전기 화학 바이오 센서 증가 관심을 받고 있다 고 건강 관리, 식품 안전, 환경 모니터링 등 다양 한 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 이 바이오 센서는 전기 신호를 생성 하는 효소에 의해 기판의 촉매 가수분해에 의존 합니다. 이러한 맥락에서 β-lactamases 더 구체적인, 더 과민 하 고 알칼리 성 인산 가수분해 효소 또는 양 고추냉이 과산화 효소10같은 많은 다른 효소 보다 실험적으로 구현 하기 더 쉬운 것 표시 했다. Β-lactamases 효소 그들을 hydrolyzing 하 여 β-락탐 항생제를 세균성 저항에 대 한 책임은 있습니다. 그들은 작은 크기의 단위체, 매우 안정, 효율적인, 그리고입니다. 또한, β-lactamases에 도메인/펩 티 드 삽입 생성 bi 기능 공상 단백질 단백질-리간드 상호작용을 연구 하는 효율적인 도구 표시 했다. 실제로, 최근 연구의 대상 항 원에 높은 선호도와 바인딩할 수 남아 공상 단백질에서 TEM1 β-lactamase 결과 항 체 변수 조각의 그 삽입을 나타났습니다. 흥미롭게도, 항 원 바인딩 TEM1 촉매 활동11,12의 allosteric 규칙 유도 표시 했다. 또한, 우리는 단백질 도메인 삽입 허용 루프에 균 licheniformis BlaP β-lactamase 단백질-리간드 상호작용13 모니터링 하는 기능 공상 단백질 생성 여러 연구에서 보였다 ,14. 우리는 최근 택시-Lys3, BlaP15이 허용 삽입 사이트에 명명 하는 nanobody를 삽입. 이 nanobody 암 탉 달걀 흰 lysozyme (HEWL)에 바인딩할 및16의 효소 활동 억제 하기 위해 표시 했다. 우리는 생성 된 하이브리드 단백질, BlaP-택시-Lys3, 라는 높은 특이성을 유지 / HEWL β-lactamase 활동 동안에 대 한 선호도 그대로 보였다. 그럼 우리가 성공적으로 β-lactamase 기술 하이브리드는 전기 화학 바이오 센서를 결합 하 여 생성 된 전기 신호 양을 했다 BlaP-택시-Lys3와 HEWL는 전극에 움직일 수 간의 상호 작용에 따라 다릅니다. 실제로, BlaP에 의해 β 락탐 항생제의 가수분해 양성자 방출 양적 전기 신호로 변환할 수 있는 유도 합니다. 이 조합은 전기 화학 바이오 센서와 하이브리드 β-lactamase 기술의 빠른, 민감한, 양적, 이며 생성 된 신호의 실시간 측정을 수 있습니다. 이 방법론은 여기 설명 되어 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1471">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:615px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>V000225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#8211;HCl</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alanine</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HClO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>34288</td>
			<td>1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>22090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzylpenicillin sodium</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>B0900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">hen egg white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">heptane</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>246654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>380539</td>
			<td>28% NH3&#160;in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657165</td>
			<td>CELLSTAR 6-Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>1AA110</td>
			<td>Lab pH meter inoLab pH 7110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vacuum and filtration system</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>NALG300-4100</td>
			<td>Filter holders with receiver, distributor : VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">potentiometric sensor chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGSTAT30 Autolab</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital multimeter, METRAHit 22M</td>
			<td>Gossen Metrawatt</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, successor Metrahit Base</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions

바이오 센서 병원 체 검출, 분자 진단, 환경 모니터링, 식품 안전 관리 등 다양 한 분야에서 점점 더 중요 하 고 구현 되 고 있다. 이러한 맥락에서 우리는 효율적인 기자 효소가 여러 단백질 단백질 상호 작용 연구로 β-lactamases를 사용. 또한, 강하게 펩 티 드 또는 구조적된 단백질/도메인의 삽입을 허용 하도록 그들의 능력 공상 단백질을 생성 하는이 효소의 사용을 권장 합니다. 최근 연구에서 우리 균 licheniformis BlaP β-lactamase에 단일 도메인 항 체 단편을 삽입. Nanobodies, 라고도 하는 이러한 작은 도메인 camelids에서 단일 체인 항 체의 항 원 묶는 도메인으로 정의 됩니다. 일반 이중 체인 항 체 처럼 그들은 높은 화력과 특이성 그들의 목표에 대 한 표시. 결과 공상 단백질 β-lactamase 활동을 유지 하면서 대상에 대 한 높은 선호도 전시. 이 nanobody 및 β-lactamase moieties 유지 기능 제안 합니다. 현재 작업에서 우리는 우리의 하이브리드 β-lactamase 시스템 바이오 센서 기술에 결합 하 여 상세한 프로토콜을 보고 합니다. 특정 바인딩 대상에 nanobody의 효소의 촉매 활동 발표 양성자의 conductimetric 측정 덕분에 검색할 수 있습니다.

설계 및 엔지니어링의 공상 단백질 BlaP-택시-Lys3
그림 1 균 licheniformis에서 BalP 클래스 A β-lactamase의 관대 한 루프에 택시 Lys3의 삽입을 나타냅니다. 삽입은 잔류물 Asp198와 Lys199 사이 수행 되었다. 트 롬 빈 분열 사이트 택시-Lys3의 각 측면에 도입 되었다. BlaP-택시-Lys3 공상 단백질 인코딩 구성 식 플라스 미드와 변형 세포 암 ?...

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The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

이 작품에서는, 우리는 하이브리드 β-lactamase 기술에 따라 conductimetric 바이오 센서를 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 새로운 방법을 보고 합니다. 이 메서드는 β-lactams의 가수분해 시 양성자의 출시에 의존합니다.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

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Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

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Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

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Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

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G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

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높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Use of a Rat Model to Study Ventral Abdominal Hernia Repair

복 부 복 부 헤 르 니 아 수리 공부 쥐 모델의 사용

Ventral abdominal hernia is a relatively common clinical condition that sometimes requires herniorraphy (surgical repair). The repair of ventral abdominal ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...