Name: the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions
Uploaded: 2018-02-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of a ÃŽÂ²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions at JoVE.com

Os autores reconhecem o Valão região da Bélgica, no âmbito dos projectos de investigação SENSOTEM e NANOTIC, bem como o nacional fundos para a investigação científica (F.R.S-F.N.R.S) pelo apoio financeiro.

1. proteína preparação da amostra
<ol><li>Produzir e purificar a proteína híbrida BlaP-táxi-Lys3 como relatado no nosso anterior estudo15. Armazenar a proteína em 50mm tampão fosfato pH 7,4 com a seguinte composição: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,24 g de KH2PO4 dissolvida em 800 mL de água destilada corrigir o pH da solução a 7,4 antes ajustando o volume final da solução a 1 L. Filter esterilizar a solução de proteí...

<ol>
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Neste trabalho apresentamos um método para funcionalizar um nanobody usando o BlaP β-lactamase como uma proteína transportadora e mostramos que podemos implementar com êxito a proteína híbrida resultante em um ensaio de sensor potenciométrico. O aspecto principal inovação do nosso trabalho em comparação com outros ensaios biosensor é o acoplamento covalente da parte de anticorpo para a atividade enzimática que gera o sinal elétrico. Esta tecnologia de inserção de proteína chamada apresenta vantagens e li...

Biosensores são dispositivos analíticos que combinam uma interação bio-molecular com dispositivos de sinalização físicos ou químicos conhecido como transdutores1. Os sinais gravados podem ser interpretados e convertidos para monitorar as interações entre os parceiros de imobilizado e livre. A maioria dos biosensores envolve o uso de um anticorpo para detectar analitos tais como hormonas ou patógeno diferentes marcadores2. Sensor de diferentes formatos podem ser usados e incluem biosensores baseados em massa, magnéticos, ópticos ou eletroquímicos. O último está entre os mais comumente usados sensores e função, convertendo um evento de vinculação em um sinal elétrico. As performances e sensibilidades de todos os biossensores baseados em anticorpos são fortemente dependentes essencialmente de dois parâmetros: i) a qualidade do anticorpo e ii) e as propriedades do sistema usado para gerar o sinal2.
Os anticorpos são proteínas massa dimérica high-molecular (150 – 160 kDa) são compostos de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A interação entre as cadeias leves e pesadas é estabilizada principalmente por interações hidrofóbicas, bem como uma ligação dissulfureto conservada. Cada cadeia inclui um domínio variável que interage com o antígeno essencialmente através de três regiões hipervariáveis chamado complementar determinando regiões (CDR1-2-3). Apesar dos inúmeros avanços no campo, a expressão em grande escala de anticorpos completos com sistemas de expressão de baixo custo (por exemplo, Escherichia coli), muitas vezes leva à produção de proteínas instáveis e agregadas. É por isso que vários fragmentos de anticorpos têm sido projetados tais como variável de cadeia única de fragmentos3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Eles consistem os domínios variáveis de respectivamente um pesado e um cadeias leves que são covalentemente ligados por uma sequência de aminoácidos sintéticos. No entanto, esses fragmentos frequentemente exibir uma pobre estabilidade e têm a tendência de agregar, uma vez que expõem uma grande parcela de suas regiões hidrofóbicas para o solvente4. Neste contexto, fragmentos de anticorpos camelid única cadeia, conhecidos como nanobodies ou VHHs, parecem ser excelentes alternativas para ScFvs. Estes domínios correspondem os domínios variáveis de anticorpos de cadeia única camelid. Em contraste com anticorpos convencionais, camelid anticorpos são desprovidas de cadeias leves e contenham apenas duas correntes pesadas5. Portanto, nanobodies são os menor monomérico fragmentos de anticorpos (12 kDa) podem ligar a um antígeno com afinidade semelhante de anticorpos convencional6. Além disso, eles apresentam melhor estabilidade e solubilidade em comparação com outros anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos. Finalmente, suas dimensões reduzidas e sua prolongada CDR3 loops que lhes permitam reconhecem epitopos crípticos e vincular a enzima sites ativos7,8. Hoje em dia, estes domínios estão recebendo atenção considerável e foram combinados com a tecnologia biosensor. Por exemplo, Huang et al. desenvolveram um biossensor baseado em nanobody para a detecção e quantificação de humano antígeno prostático específico (PSA)9.
Como mencionado acima, um parâmetro importante em ensaios de biosensor é a eficiência do sistema usado para gerar o sinal elétrico. Por esta razão, biosensores eletroquímicos enzimáticos têm atraído cada vez mais atenção e tem sido usados amplamente para várias aplicações tais como cuidados de saúde, segurança alimentar e monitoramento ambiental. Estes biosensores dependem a hidrólise catalítica de um substrato por uma enzima para gerar o sinal elétrico. Neste contexto, β-lactamases foram mostrados para ser mais específico, mais sensível e mais fácil de implementar do que muitas outras enzimas como a fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano10experimentalmente. Β-lactamases são enzimas que são responsáveis pela resistência bacteriana aos antibióticos β-lactâmicos por hidrólise de-los. Eles são monoméricos, muito estável, eficiente e de tamanho pequeno. Além disso, inserções de domínio/peptídeo em β-lactamases geram proteínas quiméricas bi-funcionais que foram mostradas para ser instrumentos eficazes para estudar as interações proteína-ligante. De fato, estudos recentes têm mostrado essa inserção da variável fragmentos de anticorpos para os resultados de β-lactamase TEM1 em uma proteína quimérico que continua a ser capaz de ligar-se com alta afinidade ao seu antígeno alvo. Curiosamente, a ligação do antígeno foi mostrada para induzir alostérica de TEM1 atividade catalítica11,12. Além disso, mostramos em vários estudos que a inserção de domínio de proteína em um loop de permissiva do Bacillus licheniformis BlaP β-lactamases gera proteínas quiméricas funcionais que são adequadas para monitorar as interações proteína-ligante13 ,14. Recentemente, nós inserimos um nanobody, denominado cAb-Lys3, para este site de inserção permissiva do BlaP15. Este nanobody foi mostrado para vincular a galinha-de-ovo lisozima (HEWL) e para inibir a atividade enzimática de16. Nós mostramos que a proteína gerada híbrido, chamada BlaP-táxi-Lys3, manteve uma alta especificidade / afinidade contra HEWL enquanto a atividade de β-lactamase permaneceu inalterada. Então nós com sucesso combinado com a tecnologia de β-lactamases de híbrido de um biosensor eletroquímico e mostrou que a quantidade de sinal elétrico gerado era dependente da interação entre BlaP-táxi-Lys3 e HEWL imobilizada em um eletrodo. Com efeito, hidrólise da β-lactâmicos por BlaP induz uma liberação de prótons que pode ser convertida em um sinal elétrico quantitativo. Esta combinação da tecnologia híbrida de β-lactamase com um biosensor eletroquímico é rápido, quantitativo e permite a medição em tempo real do sinal gerado. Esta metodologia é descrita neste documento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1471">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:615px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>V000225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>1551128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#8211;HCl</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10812846001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">alanine</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">HClO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>34288</td>
			<td>1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">casein hydrolysate</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>22090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzylpenicillin sodium</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>B0900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">hen egg white lysozyme</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10837059001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">heptane</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>246654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">methanol</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>322415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ammonium hydroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldricht</td>
			<td>380539</td>
			<td>28% NH3&#160;in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plate&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657165</td>
			<td>CELLSTAR 6-Well Plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter</td>
			<td>WTW</td>
			<td>1AA110</td>
			<td>Lab pH meter inoLab pH 7110</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vacuum and filtration system</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>NALG300-4100</td>
			<td>Filter holders with receiver, distributor : VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">potentiometric sensor chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGSTAT30 Autolab</td>
			<td>Metrohm Autolab</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital multimeter, METRAHit 22M</td>
			<td>Gossen Metrawatt</td>
			<td></td>
			<td>discontinued, successor Metrahit Base</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of a &#946;-lactamase-based conductimetric biosensor assay to detect biomolecular interactions

Biosensores estão se tornando cada vez mais importante e implementadas em várias áreas tais como detecção de agentes patogénicos, diagnóstico molecular, monitoramento ambiental e controle de segurança de alimentos. Neste contexto, usamos β-lactamases como enzimas repórter eficiente em vários estudos de interação da proteína-proteína. Além disso, sua capacidade de aceitar inserções de peptídeos ou proteínas/domínios estruturados fortemente incentiva o uso destas enzimas para gerar proteínas quiméricas. Em um estudo recente, inserimos um fragmento de anticorpo de domínio único para o β-lactamases de Bacillus licheniformis BlaP. Estes domínios pequenos, também chamados de nanobodies, são definidos como domínios de ligação de antígeno de anticorpos de cadeia única de camelídeos. Como comum anticorpos de cadeia dupla, eles mostram afinidades altas e especificidades para seus alvos. Proteínas quiméricas resultantes exibiram uma afinidade elevada contra seu destino mantendo a atividade de β-lactamase. Isto sugere que as partes nanobody e β-lactamases permanecem funcionais. No presente trabalho, relatamos um protocolo detalhado que combina o nosso sistema de β-lactamases de híbrido para a tecnologia biosensor. A vinculação específica da nanobody ao seu alvo pode ser detectada graças a uma medição titulometria dos prótons liberados pela atividade catalítica da enzima.

Design e engenharia das proteínas quiméricas BlaP-táxi-Lys3
A Figura 1 representa a inserção de táxi-Lys3 em um loop permissiva da BalP classe A β-lactamases de Bacillus licheniformis. A inserção foi realizada entre resíduos Asp198 e Lys199. Um local de clivagem de trombina foi introduzido em cada lado do táxi-Lys3. As células transformadas com um plasmídeo de expressão constitutiva codificação da proteína...

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The Use of a ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Neste trabalho, relatamos um novo método para estudar as interações da proteína-proteína usando um biossensor titulometria, baseado na tecnologia de β-lactamases de híbrido. Este método baseia-se na liberação de prótons após hidrólise da β-lactamas.

O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Bioengenharia

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

Biomolecular Detection employing the Interferometric Reflectance Imaging Sensor IRIS

Detecção de Biomolecular empregando o sensor de imagem Interferometric Reflectância (IRIS)

The sensitive measurement of biomolecular interactions has use in many fields and industries such as basic biology and microbiology, ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determinação da taxa de transporte de xenobióticos e nanomateriais através da placenta usando o<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de perfusão da placenta humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

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O uso de biossensores ópticos sem etiqueta para detectar modulação dos canais de potássio por G receptores acoplados à proteína

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Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

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A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

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Utilização de um modelo do rato para estudar hérnia Abdominal Ventral

Ventral abdominal hernia is a relatively common clinical condition that sometimes requires herniorraphy (surgical repair). The repair of ventral abdominal ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

PIP-on-a-chip: um estudo livre de rótulos de Interações Proteína-fosfoinositide

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

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Película seca baseada em fotorresiste eletroquímica Microfluidic Biosensor plataforma: Fabricação de dispositivo, ensaio em-microplaqueta preparação e operação de sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...