Name: using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in alzheimer's mouse models
Uploaded: 2017-05-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (MNR; U54GM104942), NIA (MNR; R15AG045812), Associação de Alzheimer (MNR; NIRG-12-242187), WVU Faculdade Research Senado Grant (MNR), e WVU PSCOR Grant (RNM).

1. Revestimento da rede de microeletrodos com enzimas ou camada de matriz <ol><li> Preparando a solução de matriz proteica <ol><li> Pesar 10 mg de albumina de soro bovino (BSA) e transferir para o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 985 mL de água Dl para o tubo de microcentrífuga contendo BSA. Misture a solução por agitação manual do (re-pipetagem usando 1000 mL pipeta ~ 3 vezes, até que a BSA é dissolvido). NOTA: Não use vórtice para misturar a solução pois i...

<ol>
	<li>Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+concentrations+of+free+amino+acids+and+other+electrolytes+in+cerebrospinal+fluid,+in+vivo+dialysate+of+brain,+and+blood+plasma+of+the+dog.">The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog.</a> J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).</li><li>Cavus, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+metabolites+in+the+cortex+and+hippocampus+of+epileptic+patients.">Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients.</a> Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).</li><li>Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+nicotine+on+striatal+dopamine+release+in+man:+A+[11C]raclopride+PET+study.">The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study.</a> Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).</li><li>Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+brain+microdialysis.">Overview of brain microdialysis.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2009).</li><li>Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+effects+on+glutamate+uptake+by+human+astrocytes.">Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes.</a> Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).</li><li>He, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+CCL2+polymorphisms+and+drug-resistant+epilepsy+in+Chinese+children.">The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children.</a> Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+High-Frequency+Mesoscale+Intracortical+Maps+Using+the+Genetically+Encoded+Glutamate+Sensor+iGluSnFR.">Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR.</a> J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).</li><li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission.">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).</li><li>Hefendehl, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+synaptic+glutamate+transporter+dysfunction+in+vivo+to+regions+surrounding+Abeta+plaques+by+iGluSnFR+two-photon+imaging.">Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging.</a> Nat Commun. 7, 13441 (2016).</li><li>Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+in+the+regulation+of+extracellular+glutamate+by+neurons+and+glia+in+the+rat+striatum+two+days+after+diffuse+brain+injury.">Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury.</a> J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).</li><li>Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypersensitive+glutamate+signaling+correlates+with+the+development+of+late-onset+behavioral+morbidity+in+diffuse+brain-injured+circuitry.">Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry.</a> J Neurotrauma. 29 (2), 187-200 (2011).</li><li>Hinzman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffuse+brain+injury+elevates+tonic+glutamate+levels+and+potassium-evoked+glutamate+release+in+discrete+brain+regions+at+two+days+post-injury:+an+enzyme-based+microelectrode+array+study.">Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study.</a> J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).</li><li>Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+glutamate+release+in+the+CA3+and+dentate+gyrus+of+the+rat+hippocampus.">Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus.</a> Neurobiol Aging. 32 (5), 811-820 (2009).</li><li>Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+plasma+membrane+surface+expression+of+GLAST+mediates+decreased+glutamate+regulation+in+the+aged+striatum.">Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum.</a> Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).</li><li>Hascup, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+allosteric+modulator+of+metabotropic+glutamate+receptors+(mGluR(2)+)+(+)-TFMPIP,+inhibits+restraint+stress-induced+phasic+glutamate+release+in+rat+prefrontal+cortex.">An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex.</a> J Neurochem. 122 (2), 619-627 (2012).</li><li>Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+second-by-second+measures+of+L-glutamate+in+the+central+nervous+system+of+freely+moving+rats.">Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats.</a> J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).</li><li>Matveeva, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+vesicle-associated+membrane+protein+2+expression+leads+to+a+kindling-resistant+phenotype+in+a+murine+model+of+epilepsy.">Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy.</a> Neuroscience. 202, 77-86 (2011).</li><li>Matveeva, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindling-induced+asymmetric+accumulation+of+hippocampal+7S+SNARE+complexes+correlates+with+enhanced+glutamate+release.">Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release.</a> Epilepsia. 53 (1), 157-167 (2012).</li><li>Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P301L+tau+expression+affects+glutamate+release+and+clearance+in+the+hippocampal+trisynaptic+pathway.">P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway.</a> J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).</li><li>Hunsberger, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+rescues+glutamate+alterations,+cognitive+deficits,+and+tau+pathology+associated+with+P301L+tau+expression.">Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression.</a> J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).</li><li>Hunsberger, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripherally+restricted+viral+challenge+elevates+extracellular+glutamate+and+enhances+synaptic+transmission+in+the+hippocampus.">Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus.</a> J Neurochem. , (2016).</li><li>Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+in+neurological+disorders--the+glutamate+paradox.">Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox.</a> Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).</li><li>Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+neurochemical+research+in+acute+human+brain+injury:+the+current+status+and+potential+future+for+cerebral+microdialysis.">Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis.</a> J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).</li><li>Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-referencing+ceramic-based+multisite+microelectrodes+for+the+detection+and+elimination+of+interferences+from+the+measurement+of+L-glutamate+and+other+analytes.">Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes.</a> Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).</li><li>Burmeister, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+ceramic-based+multisite+microelectrode+for+rapid+measurements+of+L-glutamate+in+the+CNS.">Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS.</a> J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).</li><li>Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+the+glutamate+clearance+time+course+from+transporter+currents+in+CA1+hippocampal+astrocytes:+transmitter+uptake+gets+faster+during+development.">Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development.</a> J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).</li><li>Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+transcriptional+neuroanatomy+of+the+rat+hippocampus:+evidence+for+wide-ranging,+pathway-specific+heterogeneity+among+three+principal+cell+layers.">Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers.</a> Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).</li><li>Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltammetric+study+of+extracellular+dopamine+near+microdialysis+probes+acutely+implanted+in+the+striatum+of+the+anesthetized+rat.">Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat.</a> J Neurosci Methods. 146 (2), 149-158 (2005).</li><li>Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+brain+penetration+injury+associated+with+microdialysis+and+voltammetry.">Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 127-135 (2009).</li><li>Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+increases+high-affinity+glutamate+uptake+in+rat+spinal+cord+synaptosomes.">Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes.</a> Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).</li><li>Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antidepressant-like+properties+of+oral+riluzole+and+utility+of+incentive+disengagement+models+of+depression+in+mice.">Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice.</a> Psychopharmacology (Berl). 219 (3), 805-814 (2011).</li><li>Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+enhances+glutamate+uptake+in+rat+astrocyte+cultures).">Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures).</a> Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).</li><li>Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+enhances+the+activity+of+glutamate+transporters+GLAST,+GLT1+and+EAAC1.">Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1.</a> Eur J Pharmacol. 578 (2-3), 171-176 (2008).</li><li>Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrode+array+studies+of+basal+and+potassium-evoked+release+of+L-glutamate+in+the+anesthetized+rat+brain.">Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain.</a> J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).</li><li>Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na(+)-dependent+glutamate+transporters+EAAT1,+EAAT2,+and+EAAT3)+of+the+blood-brain+barrier.">Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier.</a> J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).</li><li>Ramsden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+neurofibrillary+tangle+formation,+neuron+loss,+and+memory+impairment+in+a+mouse+model+of+human+tauopathy+(P301L).">Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L).</a> J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).</li><li>Oddo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple-transgenic+model+of+Alzheimer's+disease+with+plaques+and+tangles:+intracellular+Abeta+and+synaptic+dysfunction.">Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction.</a> Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).</li><li>Zang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+reveals+neuronal+degeneration+in+the+brainstem+of+the+superoxide+dismutase+1+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).</li></ol>

A técnica MEA permite a medição da cinética rápida de libertação de neurotransmissores e a absorção in vitro e in vivo. Assim, a tecnologia produz uma vasta variedade de saída de dados, incluindo os níveis de neurotransmissores tónicas, a libertação de neurotransmissores evocados, e depuração neurotransmissor. No entanto, porque o uso de AAM é um procedimento relativamente complexo, existem numerosos factores que podem necessitar de ser optimizado para utilização com sucesso. Por exe...

Medindo alterações de neurotransmissores no cérebro é uma ferramenta essencial para neurocientistas o estudo de doenças do sistema nervoso central (SNC) que são muitas vezes caracterizados por desregulao de neurotransmissores. Embora microdiálise em combinação com cromatografia líquida de alta pressão (HPLC / CE) tem sido o método mais amplamente utilizado para medir alterações nos níveis de neurotransmissores extracelulares 1, 2, 3, 4, a resolução espacial e temporal de sondas de microdiálise pode não ser ideal para neurotransmissores , tais como o glutamato, que são estreitamente regulada no espaço extracelular 5, 6. Devido aos recentes avanços na genética e na imagem, existem métodos adicionais que podem ser utilizadas para mapear glutamato in vivo. Usando repórteres glutamato fluorescentes geneticamente codificados (iGluSnFR) umd de dois fotões imagiologia, os investigadores são capazes de visualizar a libertação de glutamato por neurónios e astrócitos, tanto in vitro e in vivo, 7, 8, 9. Notavelmente, este permite a gravação de um maior campo de visão e não perturbar as ligações intrínsecas do cérebro. Enquanto estas novas técnicas ópticas permitem a visualização da cinética de glutamato e medição de respostas evocadas sensoriais e actividade neuronal, eles não têm a capacidade para quantificar a quantidade de glutamato no espaço extracelular em regiões cerebrais discretas. Um método alternativo é a matriz de microeléctrodos ligado a enzima (MEA), que pode medir selectivamente níveis de neurotransmissores extracelulares, tais como o glutamato, através da utilização de um esquema de gravao por auto-referenciados. A técnica MEA tem sido usado para estudar alterações na glutamato extracelular seguintes cerebral traumáticalesão 10, 11, 12, envelhecimento 13, 14, estresse 15, 16, epilepsia 17, 18, doença de Alzheimer 19, 20, e a injecção de um mímico viral 21 e representa um aperfeiçoamento em relação às limitações espaciais e temporais inerentes microdiálise. Considerando microdiálise restringe a capacidade de medir perto da sinapse 22, 23, AAM têm uma alta resolução espacial que permite a medidas selectivas de transbordamento glutamato extracelular perto sinapses 24, 25. Em segundo lugar, a resolução temporal baixa de microdiálise (1-20 min) limita a capacidade para investigar odinâmica rápida de liberação de glutamato e desembaraço que ocorrem no milésimo de segundo para a segunda faixa de 26. Como as diferenças na libertação ou alívio de glutamato pode não ser evidente em medidas de tónico, descansando os níveis de glutamato, pode ser essencial que a libertação de glutamato e depuração ser directamente medido. AAM permitir tais medidas, devido à sua alta resolução temporal (2 Hz) e baixos limites de detecção (&lt;1 um). Em terceiro lugar, AAM permitir a análise de alterações em sub neurotransmissores dentro de uma região particular do cérebro, tais como o hipocampo de rato ou de ratinho. Por exemplo, usando MEAs que pode ter como alvo, separadamente, o giro dentado (DG), cornu Ammonis 3 (CA3) e cornu Ammonis 1 (CA1), do hipocampo, as quais estão ligadas através de um circuito trisynaptic 27, para examinar as diferenças sub em glutamato extracelular. Por causa do tamanho das sondas de microdiálise (1 - 4 mm) de comprimento e o dano causado pela implantação 28 &lt;/ sup&gt;, 29, as diferenças sub-regionais são difíceis de abordar. Além disso, os sistemas ópticos de só permitir a estimulação através de estímulos externos, tais como uma estimulação suiça ou cintilação luz, que não permite a estimulação sub-7. Um benefício final de AAM em relação a outros métodos, é a capacidade para estudar estas sub-regiões in vivo, sem perturbar as ligações extrínsecos e intrínsecos. Aqui, descrevemos a forma como um sistema de gravação (por exemplo, FAST16mkIII) em combinação com AAM, que consiste de um microeléctrodo de vários locais de cerâmica à base, pode ser diferencialmente revestido sobre os locais de gravação para permitir a agentes interferentes a ser detectado e removido o sinal de analito. Nós também demonstrar estas matrizes podem ser utilizadas para estudos baseados em amperometria de glutamato in vivo regulação dentro da DG, CA3, e sub-regiões do hipocampo CA1 de RTG anestesiado (TauP301L) 4510 ratinhos, um m utilizadamodelo ouse da doença de Alzheimer. Além disso, nós fornecemos confirmação da sensibilidade do sistema de MEA com a dinâmica rápidas de libertação de glutamato e depuração por tratamento dos ratinhos com o riluzol, uma droga demonstrado in vitro para diminuir a libertação de glutamato e aumentar a captação de glutamato 30, 31, 32, 33, e demonstrando essas respectivas alterações in vivo no modelo do rato TauP301L.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FAST-16mkIII-8 channel</td>
			<td>Quanteon</td>
			<td>16mkIII</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode arrays</td>
			<td>CenMet</td>
			<td>W4 or 8-TRK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-3059</td>
			<td>10 g (expires after 1 month)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-6257</td>
			<td>100 mL (expires after 6 months)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate Oxidase</td>
			<td>US Biological or Sigma Aldrich</td>
			<td>G4001-01 or 100646</td>
			<td>50 UI (expires after 6 months)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>#701</td>
			<td>2 syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>BDH</td>
			<td>UN1230</td>
			<td>4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD)</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>1330560250</td>
			<td>25 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference Electrodes (RE-5B)</td>
			<td>BAS</td>
			<td>MF-2079</td>
			<td>3 electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir plate</td>
			<td>Cole-parmer</td>
			<td>EW-04804-01</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1626</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>TCI</td>
			<td>50-81-7</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine Hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>62-31-7</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>UN2920</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postassium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7647-40-7</td>
			<td>1 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>MP</td>
			<td>153502</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>BDH</td>
			<td>1310732</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pressure ejection pipettes</td>
			<td>CenMet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky wax</td>
			<td>Kerrlab</td>
			<td>625</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringe</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td>WalMart</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td>Parker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>AM systems</td>
			<td>782000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>BDH</td>
			<td>7647010</td>
			<td>2.5 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum wire</td>
			<td>AM Systems</td>
			<td>778000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solder gun</td>
			<td>Lowes or Home Depot</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimeter</td>
			<td>WalMart</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhysioSuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoSuite</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic device</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Lab Standard</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meiji EMZ microscope</td>
			<td>Meiji</td>
			<td>EMZ-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metricide</td>
			<td>Metrex</td>
			<td>102800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>25806</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td></td>
			<td>Obtain from the vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine swabs</td>
			<td>VWR</td>
			<td>S48050</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swabs</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgery drape</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>4410</td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile saline</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S5815</td>
			<td>Can make own soltuion using filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (3%)</td>
			<td>Local drug store</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>WalMart</td>
			<td></td>
			<td>Can purchase from different supplier</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using enzyme-based biosensors to measure tonic and phasic glutamate in alzheimer's mouse models

interrupção neurotransmissor é muitas vezes um componente-chave de doenças do sistema nervoso central (CNS), desempenhando um papel na patologia subjacente a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, depressão e ansiedade. Tradicionalmente, microdiálise foi o mais comum (louvado) técnica para examinar as alterações de neurotransmissores que ocorrem nestes distúrbios. Mas porque microdiálise tem a capacidade de medir as alterações lentas 1-20 minutos através de grandes áreas de tecido, ele tem a desvantagem de invasividade, potencialmente destruir as ligações intrínsecas dentro do cérebro e uma capacidade de amostragem lenta. Uma técnica relativamente nova, a matriz de microeléctrodos (MEA), tem numerosas vantagens para a medição de alterações de neurotransmissores específicos dentro de regiões cerebrais discretas à medida que ocorrem, para fazer uma abordagem espacialmente e temporalmente preciso. Além disso, utilizando AAM é minimamente invasivo, permitindo a medição de alterações de neurotransmissores in vivo. Em nosso laboratório, nós have sido especificamente interessados ​​em mudanças no neurotransmissor, glutamato, relacionada com a patologia da doença de Alzheimer. Como tal, o método descrito aqui foi usado para avaliar as perturbações do hipocampo potenciais em glutamato em um modelo de rato transgénico da doença de Alzheimer. Resumidamente, o método utilizado envolve o revestimento de um microeléctrodo de multi-local com uma enzima muito selectiva para o neurotransmissor de interesse e utilizando locais de auto-referenciar para subtrair o ruído de fundo e os interferentes. Depois de plaqueamento e de calibração, o MEA pode ser construído com uma micropipeta e reduzido para a região do cérebro de interesse utilizando um dispositivo estereotáxico. Aqui, o método descrito envolve a anestesiar RTG (TauP301L) 4510 e ratinhos utilizando um dispositivo estereotáxico para alvejar com precisão sub-regiões (DG, CA1, e CA3) do hipocampo.

Embora esta tecnologia pode ser usada para medir alterações na glutamatérgica sinalização em muitos tipos de modelos animais, tais como lesão traumática cerebral, envelhecimento, estresse e epilepsia, aqui vamos demonstrar como a tecnologia MEA pode ser usado para examinar alterações glutamatérgicos no modelo de rato transgénico de taupatia humano 19, 20. O RTG (TauP301L) 4510 ratinho expressa a mutao P301L em tau asso...

Watch this Scientific Journal Video about Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models at JoVE.com

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Aqui, descrevemos a configuração, navegação software e análise de dados para um método espacial e temporalmente precisa de medir a tônica e fásica mudanças glutamato extracelulares in vivo utilizando matrizes de microeletrodos ligado a enzima (MEA).

Utilizando biossensores baseados em Enzyme medir Tonic e Phasic glutamato na doença de Alzheimer rato Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mouse Models of Periventricular Leukomalacia

Modelos de mouse de leucomalácia periventricular

We describe a protocol for establishing mouse models of periventricular leukomalacia (PVL). PVL is the predominant form of brain injury in premature ...

Neurociência

Hyponeophagia: A Measure of Anxiety in the Mouse

Hyponeophagia: Uma Medida de ansiedade no rato

Before the present day, when fast-acting and potent rodenticides such as alpha-chloralose were not yet in use, the work of pest controllers was often ...

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

GABA-activated Correntes canal único e Tonic em fatias de cérebro de rato

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Combinado optogenética e Freeze-fratura Replica imunomarcação para examinar Arranjo específicos de entrada de glutamato receptores no mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...