Name: fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms at JoVE.com

The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.

1. decellulerede Tissue Processing <ol><li> Decellulering og Frysetørring <ol><li> Decellularize væv (r) af interesse efter en etableret protokol. BEMÆRK: Stilladser i den aktuelle undersøgelse er blevet fremstillet efter offentliggjorte decellulering protokoller til human DAT 28, porcin DDT 8, og porcin DLV 32. Kommercielt tilgængelige, uopløseligt collagen kan også anvendes til at fremstille skum og mikrobærere, såsom collagen stammer fra bovin sene, som er blevet anvendt med succes i et koncentrationsområde på 10 - 50 mg / ml. Andre uopløselige kollagenkilder kan anvendes, men kan kræve optimering for at identificere det koncentrationsområde, der vil give stabile stilladser. </li><li> Overføre den hydratiserede decellulerede væv eller oprenset kollagen i et 50 ml centrifugerør med pincet og tilsæt tilstrækkeligt dobbelt destilleret vand (ddH2O) at nedsænke vævet, toa maksimale totalvolumen på 35 ml. </li><li> Frys prøven natten over ved -80 ° C, med centrifugerøret placeret vandret under frysning for at maksimere overfladearealet for sublimation under efterfølgende lyofilisering. </li><li> Fjern låget fra centrifugerøret og overføre den frosne prøve i et frysetørring krukke. </li><li> Lyofilisere prøven under anvendelse af en laboratorie frysetørrer i 48 - 72 timer, eller indtil alt tørret. BEMÆRK: Tørretid kan variere for forskellige lyophilizers og decellulerede væv. </li><li> Fint hakke det lyofiliserede ECM i små stykker (~ 1 - 2 ud mm3) ved anvendelse af skarpe kirurgisk saks. </li><li> Opbevar hakket ECM i en ekssikkator indtil den er klar til videre forarbejdning. BEMÆRK: Det anbefales, at det hakkede ECM straks anvendes til at forhindre fugtabsorption fra miljøet. </li></ol></li><li> Cryomilling (ekstraudstyr til skum fabrikation) <ol><li> Fyld en 25 ml rustfri stål formalingskammeret til laboratory kuglemølle-system med hakket lyofiliseret ECM og tilføje to 10 mm rustfri formalingskugler. </li><li> Tæt og fuldstændigt nedsænkes loaded formalingskammeret i flydende nitrogen i 3 min. </li><li> Mølle den frosne prøve i 3 min ved 30 Hz (1.800 rpm). </li><li> Gentage trin 1.2.2 og 1.2.3, indtil ECM formales til et fint pulver. BEMÆRK: Antallet af gange, bør gentages disse trin kan variere mellem ECM kilder. Fx DAT kræver typisk 3 fræsecykler at generere et fint pulver. </li><li> Pulveret overføres ved hjælp af en scoopula i et hætteglas, slutter tæt, og opbevar i en ekssikkator. </li></ol></li><li> ECM Suspension Fremstilling <ol><li> Afvej 250 mg enten hakket (for skum) eller cryomilled (for skum eller mikrobærere) ECM og overføre det til et 15 ml centrifugerør. Se trin 1.1.6 og 1.2 til fremstilling af hakket ECM og cryomilled ECM hhv. BEMÆRK: Denne protokol er beregnet til fremstilling af en 50 mg / ml ECM suspenning, som anbefales til human DAT, porcin DDT, og porcin DLV. Afhængigt af den specifikke ECM kilde, kan ensartede suspensioner genereres ved højere eller lavere koncentrationer udgangsmaterialer. </li><li> Tilsæt 5 ml 0,22 M NaH 2 PO4 (pH 5,4) buffer til centrifugerøret og markere væskeniveauet på røret. </li><li> Forberede en α-amylase stamopløsning ved tilsætning 7,5 mg α-amylase til 1 ml 0,22 M NaH 2 PO4 (pH 5,4) puffer. Tilsæt 100 pi af α-amylase stamopløsning (0,75 mg α-amylase, 0,3% vægt / vægt af tør væv) til prøven. Tilføje 0,22 M NaH 2 PO4 at opnå et endeligt volumen på 10 ml. </li><li> Suspensionen omrystes kontinuerligt ved 300 rpm i 72 timer ved stuetemperatur. </li><li> Centrifugeres suspensionen ved 1500 xg i 10 min. indsamle og kassér supernatanten uden at forstyrre fordøjede ECM pelleten omhyggeligt. Resuspender pelleterede materiale i 10 ml 5% NaCl fortyndet i Hedeselskabet 2 O. </li><li> Gentag trin 1.3.5 for i alt to skylninger med 5% NaCI i Hedeselskabet 2 O. </li><li> Bortkast supernatanten og resuspender pelleterede materiale i 10 ml Hedeselskabet 2 O. </li><li> Suspensionen omrystes kontinuerligt ved 300 rpm i 10 minutter ved stuetemperatur. </li><li> Centrifugeres suspensionen ved 1500 xg i 10 min. indsamle og kassér supernatanten uden at forstyrre fordøjede ECM pelleten omhyggeligt. </li><li> Tilsæt 0,2 M eddikesyre til 5 ml mærket foretaget i trin 1.3.2. </li><li> Suspensionen omrystes kontinuerligt ved 120 rpm O / N ved 37 ° C. </li><li> Homogenisere ECM suspensionen ved stuetemperatur i ti-sekunders intervaller under anvendelse af en håndholdt homogenisator forsynet med en savtand 10 mm bred sonde indtil ingen synlige fragmenter tilbage. Anbring suspension i et bæger med koldt vand mellem homogenisering intervaller for at undgå overophedning. BEMÆRK: Afhængigt af ECM kilde, kan yderligere fortynding i 0,2 M eddikesyre kræves for at opnå en homogen suspension. Everforbrug afkøling af ECM suspensionen kan resultere i en forøgelse af viskositeten, der kan forstyrre effektiv homogenisering. Hvis der bemærkes en forøgelse af viskositeten, kan prøven rewarmed til 37 ° C og underkastes yderligere forarbejdning. </li><li> Opbevares ved 4 ° C i op til en måned forud for skum eller mikrobærer fabrikation. </li></ol></li></ol> 2. ECM-afledte Foam Fabrication <ol><li> Inkubér ECM suspensionen fra trin 1.3.13 (hakket eller cryomilled) ved 37 ° C med kontinuerlig omrøring ved 120 opm, indtil suspensionen er varm. </li><li> Fortynde ECM suspension i 0,2 M eddikesyre surt til den ønskede koncentration. BEMÆRK: Afhængigt af ECM kilde, stabile skum kan fremstilles i området på 10 - 100 mg / ml, med 15 - 50 mg / ml som det anbefalede interval for DAT, DDT og DLV. Typisk vil skum fremstillet ved højere koncentrationer være lidt mindre porøs men mere stabil i kultur og nemmere at håndtere. </li><li> Anvendelse af en 3 ml sprøjte wed en 18 G nål for at forhindre bobledannelse i ECM suspension, fylde den ønskede form med ECM suspensionen. Til at fremstille DAT, DDT, og DLV skum, dispensere 400 pi 35 mg / mL ECM suspension i en 48-brønds cellekultur-behandlede plade. BEMÆRK: Formen af ​​den valgte form og volumen af ​​ECM suspension vil bestemme geometrien af ​​det resulterende skum. </li><li> Dække og fryse formene natten over ved at placere dem i en -20 ° C eller -80 ° C fryser. BEMÆRK: frysepunkt kan påvirke porøsiteten af ​​skummene. Forventes større porer når prøverne frosset ved -20 ° C i sammenligning med -80 ° C på grund af dannelsen af større iskrystaller 33. At fabrikere skum med en ensartet porøs struktur, sikre, at formen ikke er i kontakt med en ledende overflade for at forhindre retningsbestemt afkøling. </li><li> Placer forme indeholdende de frosne prøver til et lyofiliseringsapparat kolbe. Slut frysetørreren kolben til laboratORY frysetørrer-system og tørre i 24 timer. BEMÆRK: Det er vigtigt, at prøven forbliver frosne før frysetørring. </li><li> Opbevar de frysetørrede skum i en ekssikkator, til. </li></ol> 3. ECM-afledte Mikrobærer Fabrication via elektrospraying BEMÆRK: En oversigt over elektrospraying konfigurationen er vist i figur 2. <ol><li> Inkubér cryomilled ECM suspensionen fra trin 1.3.13 ved 37 ° C med kontinuerlig omrøring ved 100 omdr./min O / N. BEMÆRK: Cryomilled ECM bruges til at fabrikere ECM-afledte mikrobærere at sikre større ensartethed i suspensionen og forhindre tilstopning under elektrospraying. </li><li> Belastning 3 ml ECM suspension i en 3 mL Luer lock sprøjte og vedlægge en vinget infusionssæt på boringen i sprøjten. BEMÆRK: Der kan anvendes en række needle målere, der erkender, at udvælgelsen kan påvirke størrelsen og formen af ​​de resulterende mikrobærere. Til fabricate DAT, DDT, og DLV mikrobærere, brug en 25 G nål. </li><li> Fastgør sprøjten inden sprøjtepumpen. Fastgøre nålen til en destilleringsstand og positionere kanylespidsen lodret i en afstand på 4 - 6 cm fra toppen af ​​en lav-formen Dewarkar (250 - 500 ml størrelsesområde anbefales). </li><li> Vedhæfte et krokodillenæb elektrode til spidsen af ​​kanylen og forbinde det til den positive terminal af højspændings- strømforsyning. </li><li> Fold en strimmel af aluminiumfolie (12 x 5 cm) over kanten af ​​sugekolben. </li><li> Vedhæfte et andet krokodillenæb elektrode til den ydre kant af folien og slutte den til jorden kilde terminal af strømforsyningen. </li><li> Hans position Dewarkar med flydende nitrogen til ca. 1 cm fra toppen, således at ¾ af folien er neddykket. BEMÆRK: Det er vigtigt at holde Dewarkar fyldes med flydende nitrogen. Overfladen af ​​det flydende nitrogen må ikke være mindre end 2 cm fra toppen af ​​kolben under elektrospraying process. Kontinuerlig påfyldning af det flydende nitrogen er nødvendig for at opretholde et konstant niveau under elektrospraying. </li><li> Indstil sprøjtepumpen til en infusionshastighed på 30 ml / time. BEMÆRK: Varierende infusionshastigheden kan ændre mikrobærer form og diameter, men den anbefalede område på 25 - 35 ml / time. Selv om det er stærkt afhængig af viskositeten af ​​suspensionen, kan strømningshastigheder under 25 ml / time resultere i frembringelse af større mikrobærere. Ved meget lave strømningshastigheder, kan størrelsen og formen af ​​mikrobærerne bliver mindre homogen. Ved infusionshastigheder over 35 ml / h, kan ensartetheden af dråberne frembragt via elektrospraying blive afbrudt, hvilket resulterer i ikke-sfæriske mikrobærere med et bredere størrelsesfordeling 34. </li><li> Påfør en spænding på 20 kV og tænd for sprøjtepumpen at indlede elektrospraying. BEMÆRK: Spændingen kan varieres til at afstemme størrelsen af ​​mikrobærerne og har tendens til at have en større indvirkning på diameter end infusion sats. Det anbefalede spændingsområde, er 15 - 25 kV. Et fald i mikrobærer diameter forventes med en stigning i spændingen 35. </li><li> Når infusionen er gennemført, omhyggeligt hæld overskydende flydende nitrogen fra Dewar, efterlader mikrobærerne er suspenderet i ~ 25 ml flydende nitrogen for at sikre de forbliver frosne. </li><li> overdrage mikrobærerne med flydende nitrogen i et 50 ml centrifugerør ved at hælde i en glidende bevægelse. Saml alle frosne mikrobæreelementer tilbage i Dewar med et scoopula og tilføje dem til centrifugerør. BEMÆRK: Afhængig af størrelsen af ​​Dewar, kan mikrobærerne i flydende nitrogen indledningsvist hældt i en mellemstor beholder, og derefter overført straks ind i 50 ml centrifugerør. </li><li> Dæk centrifugerør indeholdende mikrobærerne i flydende nitrogen med aluminiumsfolie perforeret med små huller i forberedelse til lyofilisering. </li><li> Placer den overdækkede centrifugerør i en lyofiliseringsapparat kolbe. Umiddelbart kolben forbindes til frysetørreren og tør prøverne O / N. BEMÆRK: Det er meget vigtigt at holde mikrobærerne er suspenderet i flydende nitrogen for at sikre, at de ikke tø før dette trin, som optøning kan resultere i kollaps og / eller aggregering. DAT, DDT og DLV mikrobærere fremstillet ved en koncentration på 35 mg / ml under anvendelse af de elektrospraying ovenfor beskrevne vil typisk have en hydratiseret diameter i området mellem 350 - 500 um i størrelse. Størrelsesfordelingen kan variere afhængigt af ECM kilde. </li><li> Opbevar de frysetørrede mikrobærerne i en ekssikkator, til. </li></ol><img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig2.jpg" /> Figur 2. Oversigt over elektrospraying Apparat anvendt Mikrobærer Fabrication. A: Billede som viser indretningen af nøglen elektrospraying udstyr, herunder sprøjtepumpenog højspændingsstrømforsyning samt positioneringen af ​​nålen i forhold til Dewar af flydende nitrogen. B: elektrospraying skematisk, herunder de anbefalede intervaller for spændingen, infusionshastighed, og afstand. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> 4. Forberedelse Skum og Mikrobærere til celledyrkning <ol><li> rehydrering <ol><li> Overføre de frysetørrede skum med pincet i et 50 ml centrifugerør indeholdende overskud absolut ethanol (~ 99,9%) (~ 5: 1 mellem ethanol og skummer). Tilsvarende resuspendere de lyofiliserede mikrobærere i overskud absolut ethanol inden for den oprindelige centrifugerør anvendes til opsamling. Under anvendelse af en serologisk pipette filtrere mikrobærerne gennem en rustfri sigte med en defineret maskestørrelse i en ny 50 ml centrifugerør for at fjerne eventuelle aggregater og udvælgelse af ønskede størrelsesområder. BEMÆRK: Hvis skummet er fremstillet inden TCPS plader, kan de blive rehydreret direkte inden for disse fartøjer. </li><li> Inkuber ved 4 ° C i 4 timer eller indtil skum eller mikrobærere har tyngdekraften fast til bunden af ​​centrifugerøret. Udføre alle efterfølgende trin i en laminær strømning under anvendelse af sterile reagenser og korrekt aseptisk teknik. </li><li> Fjern absolut ethanol under anvendelse af en serologisk pipette og tilsæt overskud (5: 1 forhold) 95% ethanol fortyndet med steril phosphatpufret saltopløsning (PBS) til skeletterne. Inkuber ved 4 ° C i 4 timer, eller indtil ECM-afledte scaffolds er sunket til bunden af ​​rehydrering fartøj. </li><li> Gradvist rehydrere stilladser gennem en ethanol-serien (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 og 0%, fortyndet med sterilt PBS). Ved hvert trin inkuberes ved 4 ° C, indtil de scaffolds er sunket til bunden af ​​beholderen før udskiftning af opløsningen. Afgasses stilladser under let vakuum hvis bobledannelse inden skeletterne er observed. </li><li> Erstatte steril PBS i yderligere to skylninger for at fjerne resterende ethanol. </li><li> Opbevares i 100% sterilt PBS ved 4 ° C, indtil klar til cellekultur. Brug stilladser inden for 1 - 2 uger efter rehydrering. </li></ol></li><li> Forberedelse til cellepodning <ol><li> På dagen forud for såning, overføre skummene ved anvendelse af pincetter i cellekultur behandlet godt plader eller transwell inserts og tilsæt tilstrækkeligt celledyrkningsmedium (vælges baseret på celletypen af interesse) til at dykke stilladserne (fx 2,5 ml / stillads i en plade med 12 brønde). Tilsvarende tillader mikrobærerne af tyngdekraften slå sig ned i centrifugeglasset, forsigtigt fjerne PBS under anvendelse af en serologisk pipette uden at forstyrre mikrobærerne, og tilføj celledyrkningsmedium for at opnå en 5: 1-forhold mellem medium til mikrobærerne. BEMÆRK: såning humane ASC&#39;er, udnytte Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM): Hams F12 næringsstof suppleret med10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. </li><li> Erstatte celledyrkningsmediet i alt en skylning. </li><li> Ækvilibrering af stilladser natten over i cellekultur medium ved 37 ° C. Skeletterne vil være klar til celle såning den næste dag. BEMÆRK: Skummene kan statisk podet i cellekultur indsætter eller vævskulturplader brøndsplader 29, eller dynamisk podet på et laboratorie shaker 36. Afhængigt af ECM kilde, forarbejdningsmetoder og suspensionskoncentration, kan dynamisk podning forbedre indledende cellebinding, proliferation og infiltration. Mikrobærerne kan podes dynamisk med en spinner dyrkningssystem 11. </li></ol></li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Generelt kan bioscaffolds afledt decellulerede væv tættere tilnærme den komplekse 3D sammensætning og struktur ECM i den native cellulære mikromiljø sammenlignet med syntetiske stilladser eller standarddyrkningsbetingelser modeller baseret på 2D TCPS. Som tidligere omtalt celle-ECM-interaktioner er af kritisk betydning for mediering cellulær adfærd både i kultur og i legemet 1. Erkender, at de biokemiske, biofysiske og biomekaniske egenskaber af ECM er unikke for hvert væv, er der en stigende beviser til støtte for begrundelsen for at anvende vævsspecifikke tilgange i udformningen af ​​biomaterialer til vævsopbygning, samt i udviklingen af ​​mere fysiologisk relevante kultur modeller for in vitro-forsøg 20. Udnytte decellulariseret væv som udgangsmateriale, kan vore metoder inkorporere den komplekse sammensætning af den vævsspecifikke ECM under mere customizable stillads formater. Mens de mekaniske og enzymatiske procestrin vil resultere i et tab af det native ECM ultrastruktur har tidligere undersøgelser med DAT vist, at instruktive virkninger af adipøst-afledte ECM er konserveret i disse stillads formater, hvilket antyder, at bioscaffold sammensætning er en nøglemediator af cellefunktion 11, 29. En væsentlig fordel ved at bruge ECM-afledte skum og mikrobærere som cellekultur-substrater sammenlignet med de intakte decellulariserede væv er, at de er mere homogene, hvilket kan forbedre ensartethed i cellefordeling og celle-celle / celle-ECM-interaktioner. De her beskrevne fremgangsmåder kan anvendes til at generere en bred vifte af vævsspecifikke bioscaffolds til anvendelse i cellekultur og væv-maskiner. For eksempel, i tillæg til DAT, DDT, og DLV, vores laboratorium har med succes anvendt disse teknikker til at danne 3D porskellige skum anvender decellulerede knogle, brusk, nucleus pulposus, og annulus fibrose, såvel som kommercielt tilgængeligt, uopløseligt collagen fremstillet fra bovin sene. Med en in vitro perspektiv kunne disse bioscaffolds anvendes som grundlag for højere-fidelity 3D kulturmodeller til undersøgelse cellebiologi, fysiologi eller sygdom patologi 38, som bioaktive substrater i high-throughput lægemiddel-screening platforme 39, eller som instruktive matricer til stamceller celledifferentiering 40, 41. DAT, DDT og DLV skum fremstillet i koncentrationer på 25 - 50 mg / ml er stabile i lang sigt in vitro-dyrkning (testet op til 28 dage). Endvidere kan alle tre typer mikrobærere understøtte cellebinding og proliferation under dynamiske forhold i en lav forskydning spinner dyrkningssystem (10 - 15 rpm) i mindst 2 uger. Til in vivo-anvendelser, den biokompatible og biodegradable ECM-afledte skum og mikrobærere lovende som off-the-shelf produkter til at stimulere konstruktiv vævsomdannelse og regenerering 11, 29. Endvidere kunne de cellebaserede klæbemiddel skeletter anvendes som levering celleterapi systemer 42, 43. Som et eksempel blev DAT skum vist at fremme angiogenese og adipogenese når podet med allogene ASC&#39;er og implanteret subkutant i en immunkompetent rottemodel 29. I forhold til det intakte DAT, skum den mere stærkt forarbejdede DAT nedbrydes meget hurtigere, med en reduktion i volumen 50% bemærket ved 3 uger som de blev integreret med værtsvæv, og næsten fuldstændig resorption af 12 uger. Imidlertid skummene inducerede også en mere potent angiogent respons, hvilket antyder, at enzym-fordøjet ECM havde unikke pro-regenererende virkning. Tilsvarende kunne ECM-afledte mikrobærere anvendes som in vitro &lt;/ em&gt; celledyrkningssubstrater inden dynamiske dyrkningssystemer og som injicerbare celle leveringsvehikler 11, 30, 44. Mere specifikt kunne mellem, diameter og stor overflade af mikrobærerne muliggøre leveringen af en stor mængde celler i et lille volumen, men samtidig give en matrix, der kan bidrage til at understøtte cellelevedygtighed og øge celletilbageholdelse på injektionsstedet 30. Før anvendelse i enhver levende system, er det afgørende at sikre, at kilden ECM det væsentlige er uden antigene cellulære komponenter og / eller potentielt cytotoksiske decellulering reagenser, der kan udløse en negativ værtsrespons 7. Det proteolytiske enzym pepsin er almindeligt anvendt i fremstillingen af ECM-afledte hydrogeler 15. Pepsin er et ikke-specifik protease, som vil fordøje kollagen og andre ECM-proteiner into små fragmenter 45. Mens hydrogeler fremstillet af pepsinfordøjet ECM er blevet rapporteret at have celle-lærerigt virkninger, en begrænsning er, at disse materialer har en tendens til at være yderst mekanisk svag 46. I vores indledende udvikling af DAT mikrobærere, vi udnyttet en sammensat tilgang, hvor pepsinfordøjet DAT blev kombineret med alginat og tilsat dråbevis til CaCl2 til dannelse sfæriske kugler 30. Perlerne blev efterfølgende foto-tværbundne og alginatet blev ekstraheret ved anvendelse natriumcitrat. Ud over kravet om kemisk tværbinding, en nøgle begrænsning var, at mikrobærerne fremstillet med denne fremgangsmåde havde dårlig stabilitet under et størrelsesområde 900-950 um 30. I stedet for pepsin, de metoder, der præsenteres her udnytte en mere mild fordøjelse af ECM med den glycolytiske enzym α-amylase, som postuleres at spalte carbohydratgrupper fra telopeptide regioner af collagen, og derved øge opløselighed i eddikesyre 37. Denne fremgangsmåde muliggør isolering af højpolymeriseret kollagen, som kan anvendes til at frembringe rene ECM-afledte skum og mikrobærere uden behov for kemisk krydsbinding eller andre additiver. Disse bioscaffolds stabiliseres gennem fysiske interaktioner og hydrogenbinding mellem velbevarede collagenfibriler, svarende til collagenet i det native ECM mikromiljø. Skummene er en meget fleksibel platform, der kan fremstilles i en lang række geometrier afhængigt af den specifikke form valgt. For cellekultur-studier kan skummene støbes direkte i TCPS brønds plader til dannelse af belægninger eller 3D scaffolds af varierende tykkelse. At fabrikere 3D skumstoffer med meget ensartede overflader, anbefales det, at en tilpasset formen er udformet som kan forsegles på begge sider med plast eller objektglas. Enten hakket eller cryomilled ECM kan anvendes til at syntetisereskummene. Generelt har vi fundet, at de cryomilled skum tendens til at være makroskopisk blødere og har et mere forstyrret ultrastruktur ved lavere koncentrationer 31, 36. Afhængigt af vævskilden kan de yderligere bearbejdningstrin mekaniske forårsager ændringer af ECM sammensætning, som kan påvirke cellefunktion. For eksempel i vores tidligere arbejde, blev laminin påvist i hakket DLV skum, men ikke cryomilled DLV skummer 31. I modsætning hertil blev der collagen I, collagen IV, laminin og fibronectin påvises i både hakket og cryomilled DAT skummer 36. Ud over de mekaniske bearbejdningstrin, kan porøsiteten og porestørrelsen af skummene indstilles til en vis grad ved at variere koncentrationen ECM suspension og frysepunkt 47. Generelt lavere koncentrationer skum (~ 10 - 15 mg / ml) er kvalitativt mere porøs, men kan kontrahere hurtigt og har dårligstabilitet i langtidskultur 31, 36. Tilsvarende vil en langsommere frysehastighed, typisk ved en højere frysetemperatur, kan resultere i større porer i skummet på grund af størrelsen af de iskrystaller, der dannes under fabrikation 29. Alle disse parametre kan påvirke celleinteraktioner med de materialer, herunder binding, infiltration, og remodeling. For eksempel kan cellevækst på skum, der er fremstillet med højere koncentrationer ECM begrænses til de overfladeområder, især med hakket ECM kilder og under statiske dyrkningsbetingelser 36. For mikrobærerne, de vigtigste parametre, der kan tunede er koncentrationen ECM suspension, nåletykkelse, og påtrykt spænding, med højere koncentrationer typisk opnåelse mikrobærere, der er mere stabile under langvarig dynamisk kultur. Efter indledningen af ​​elektrospraying, ECM suspension dråber bør hurtigt falde ind i midten af ​​kolben, i den retning af aluminiumfolielaget samler. At forhindre aggregering, er det vigtigt, at perlerne kontakte flydende nitrogen før folien. Afstanden mellem nålen og overfladen af ​​det flydende nitrogen kan justeres til at opfylde disse krav. Det er vigtigt at bemærke kan kræves, at optimering afhængigt af egenskaberne af hver specifik ECM kilde, især ved valg af koncentrationsinterval der vil generere stabile bioscaffolds. En anden vigtig faktor er den decellulering protokol, der bruges til at generere de udgangsmaterialer, som decellulering metoder, der nedbryder ECM eller tilstedeværelsen af resterende reagenser (fx overfladeaktive midler) kan have en negativ indflydelse på stabiliteten af de resulterende skum og mikrobærere. Hvis udfordringerne er stødt med bioscaffold stabilitet, muligheder, der kan undersøges omfatter brug af en mere gradvis rehydrering proces, hvilket øger ECM suspension koncentration, og udforske hakket versus cryomilled ECM. Skulle alle disse muligheder ikke løser problemet, kan det være nødvendigt at udforske alternativ decellulering protokoller eller ECM kilder. For at sikre reproducerbarhed under stillads produktion, skal man være særlig opmærksom på visse trin i protokollen. Når cryomilling de decellulariseret væv, anbefales det, at formaling udføres umiddelbart efter lyofilisering i et tørt miljø for at reducere sandsynligheden for partikelaggregering som følge af absorption af fugt fra omgivelserne. Under mikrobærer fabrikation, foreslås det, at suspensionen elektrosprayes i små partier, med et maksimalt volumen på 3 ml, for at undgå problemer med prøve afkøling, der kan resultere i tilstopning af nålen. Endvidere er det vigtigt, at mikrobærerne ikke er tilladt at tø efter elektrospraying proces. At opretholde deres sfæriske geometri og mekanisk stabilitet, microcarriter skal indsamles fra den flydende nitrogen, som transporteres i en flydende nitrogen-fyldt beholder, og straks lyofiliseret. Endelig, for både skum og mikrobærerne, er det afgørende, at der er udført rehydrering trin langsomt over en periode på flere dage. Hurtig rehydratisering kan resultere i strukturel kollaps på makro- og / eller mikro-skala. Endvidere skal rehydrering ske langsomt for at forhindre dannelsen af ​​små luftbobler i stilladset, som kan kræve en betydelig mængde tid at afgasse under let vakuum. Sammenfattende kan de metoder, der præsenteres i dette papir anvendes til fremstilling af en bred vifte af vævsspecifikke skum og mikrobærere består af rene, ikke-kemisk tværbundet ECM. En fordel for biologiske forskere er, at bioscaffolds er lette at håndtere og kan behandles på lignende måde til væv, når der udføres analyser med teknikker såsom histologi, immunohistokemi eller gen og protein ekspressionsassays.Desuden kan ECM-afledte scaffolds være enzymatisk nedbrudt at udtrække podede cellepopulationer eller kan anvendes direkte som biologisk nedbrydelige og biokompatible celle leveringsvehikler. Samlet set er dette fleksible platform teknologi har stor nytte for mange applikationer, herunder til 3D cellekulturer studier der undersøger celle funktion, som celleekspansion substrater, og som pro-regenererende bioscaffolds.

Den ekstracellulære matrix (ECM) består af et kompleks 3D netværk af proteiner, glycoproteiner og polysaccharider 1. Engang blev betragtet som en overvejende strukturelle rammer, er det nu velkendt, at ECM inkorporerer en bred vifte af bioaktive molekyler med vigtige funktionelle roller 2. Celle-ECM-vekselvirkninger kan dirigere celleoverlevelse, adhæsion, migration, proliferation og differentiering 3. Mens de store klasser af ECM makromolekyler er generelt godt konserveret blandt væv og arter, hvert væv har en unik matrixsammensætning og arkitektur 4. Samlet set den vævsspecifikke ECM tilvejebringer en instruktiv mikromiljø, som medierer funktion fra subcellulære til vævet / organ skala 5. På grund af den kritiske rolle ECM i formidling cellulær funktion, har der været stigende interesse for deling af ECM-afledte bioscaffolds til applikationer i vævskonstruktion og regenerativ medicin. Især er fremgangsmåden ifølge decellulering blevet grundigt udforsket som et middel til at opnå ECM fra en bred række væv til anvendelse som et stillads materiale til vævsregeneration og cellelevering 5, 6, 7. Decellulering involverer typisk en række mekaniske, kemiske og / eller biologiske behandlingstrin rettet mod at fjerne celler og cellulære komponenter, mens ideelt forårsager minimale ændringer til 3D-strukturen og sammensætningen af ECM 8. Gennem landmåling litteraturen kan forskellige decellulering protokoller identificeres for stort set alle væv i legemet 7. Mens decellulerede væv, kan anvendes direkte som implanterbare stilladser eller 3D celledyrkningssubstrater, kan cellulær infiltrationbegrænses i væv med en tæt ECM struktur 9. Endvidere kan den naturlige heterogenitet i ECM forårsage variabilitet i cellebinding og distribution inden for de decellulariseret matricer, som potentielt kan påvirke den cellulære reaktion 10. Samlet, mens lovende for nogle anvendelser anvende decellulariserede væv i deres intakte form tilbyder begrænset alsidighed med hensyn til tuning stillads egenskaber, herunder formen, porøsiteten, og stivhed, samt leveringsmåden for in vivo anvendelser. For at omgå disse begrænsninger er talrige forskningsgrupper anvende yderligere forarbejdningsprocesser, som kan generere tilpassede stillads formater ved hjælp decellulariserede væv som et basismateriale. I den simpleste form, kan det betyde cryomilling de decellulariseret væv til at generere injicerbare vævsspecifikke ECM partikler 11. Disse ECM partikler kan inkorporeres som en celle-instructive komponent i sammensatte stilladser med andre biomaterialer, såsom in situ krydsbinding hydrogeler 12, 13, 14. Ud over mekanisk bearbejdning, kan decellulerede væv også underkastes enzymatisk spaltning med proteolytiske og / eller glycolytiske enzymer til fabrikere ECM-afledte hydrogeler, skum, mikrobærere og belægninger 15, 16, 17, samt at syntetisere bioinks for 3D-printning 18. Udover vævsmanipulering applikationer, ECM-afledte bioscaffolds et stort potentiale til generering af højere kvalitet in vitro modeller for biologisk forskning. Der er et stort behov for at udvikle 3D-cellekultursystemer, der bedre rekapitulere indfødte cellulære mikromiljø 19. Mest in vitro cell kultur undersøgelser til dato er foretaget på vævskultur-polystyren (TCPS), som har ringe korrelation med det biologisk kompleks og dynamisk cellemiljø fundet i levende væv 20. Mens praktisk for at studere cellulære interaktioner i et kontrolleret miljø, dyrkning af celler på disse forenklede stive 2D substrater ændrer cellebinding og morfologi samt både celle-celle- og celle-ECM interaktioner 21, 22. De cellulære tilpasninger observeret på 2D TCPS kan påvirke intracellulære signalveje, der regulerer forskellige cellefunktioner, herunder overlevelse, proliferation, migration og differentiering, hvilket rejser spørgsmålet om relevansen af 2D studier i modellering in vivo-systemer 23. Der har været stigende erkendelse af, at cellulær adfærd kan variere meget i 2D versus 3D-systemer 24, og at biokemiske og biomechanical signalering med ECM er vigtige mediatorer af cellefunktion 25. Mange grupper har forsøgt at overvinde begrænsningerne af etablerede 2D systemer ved belægning TCPS med ECM komponenter såsom collagen, laminin og fibronectin. Selv om disse strategier kan forbedre cellevedhæftning og kan ændre cellulære responser, forbliver disse modeller begrænset af deres 2D konfiguration, som ikke efterligner den komplekse rumlige organisation eller biokemien af det native ECM 26, 27. Vores bioteknologi laboratorium har været interesseret i udvikling af ECM-afledte bioscaffolds som substrater for 3-D cellekultur og væv-maskiner. Især har vi banebrydende for anvendelsen af decellulariserede fedtvæv (DAT) som et stillads platform for adipose regenerering 28. Desuden har vi etableret fremgangsmåder til syntese 3D mikrobærere og porøst skum under anvendelse af DAT spaltet med det proteolytiske enzym pepsin eller glycolytisk enzym α-amylase 29, 30, 31. Især har vi påvist på tværs af alle disse stillads formater, som adipøst-afledte ECM giver en induktiv mikromiljø for adipogenisk differentiering af humane adipøst afledte stamceller / stromale celler (ASC&#39;er) i kultur. For nylig vi udvidet vores fremstillingsmetoder til at generere 3D porøse skum fra α-amylase-fordøjet svine decelluleret venstre ventrikel (DLV) (decellulering metoder tilpasset fra Wainwright et al. 32), og viste, at de giver en støttende platform til induktion tidlig cardiomyogenic markør-ekspression i humane perikardielle fedt-afledte ASC&#39;er 31. Denne artikel beskriver i detaljer fremgangsmåder til syntese af ikke-kemisk tværbundne 3D porøse skum og mikrobærere afledt rentfra α-amylase-spaltet ECM til anvendelse som biologisk kompleks 3D in vitro cellekultur-substrater og som biomaterialer til vævsregenerering. I teorien kan enhver ECM kilde med høj molekylvægt collagen anvendes som udgangsmateriale til disse teknikker. For at demonstrere fleksibiliteten af denne fremgangsmåde, er blevet anvendt metoder til at generere vævsspecifikke bioscaffolds anvendelse af humant DAT, porcin decellulerede hudvæv (DDT) 8, og porcin DLV som repræsentative eksempler. Figur 1 tilvejebringer et visuelt overblik over fremstillingsprocessen for ECM-afledte skum og mikrobærere. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig1.jpg" /> Figur 1. Oversigt over Fremgangsmåde til fremstilling af Vævsspecifikke ECM-afledte Skum og Mikrobærere. 1. decellulariseret væv, fremstillet ifølge etablerede decellularization protokoller, kan anvendes til vævsspecifik ECM-afledte bioscaffold fabrikation. Makroskopiske billeder vises af hydratiseret human DAT (fremstillet som beskrevet i Flynn 2010 28), porcint DDT (fremstillet som beskrevet i Reing, JE et al. 2010 8 personer), og porcin DLV (fremstillet som beskrevet i Wainwright et al. 2010 32 ), som repræsentative eksempler på ECM kilder, der kan anvendes som udgangsmaterialer. Scale søjler repræsenterer 3 cm. 2. De decellulariseret væv lyofiliseres, og derefter 3. mekanisk hakket. Scale søjler repræsenterer 1 cm. 4. Det hakkede ECM kan derefter cryomilled, der er valgfri for skum fabrikation, men kræves til mikrobærer syntese. Skala søjle repræsenterer 3 mm. 5. Det hakkede eller cryomilled ECM fordøjes herefter med α-amylase og homogeniseret for at skabe en homogen ECM suspension. Skalalinjen betegner 1 cm. <strong&gt; 6a) For skum fabrikation, er ECM suspensionen overført til en brugerdefineret støbeform, nedfrosset og lyofiliseret for at danne en porøs 3D stillads med en veldefineret geometri. Skalalinjen betegner 1 cm. 6b) For mikrobærer fabrikation, er det cryomilled ECM suspension elektrosprayes at generere diskrete sfæriske mikrobærere. Skala søjle repræsenterer 2 mm. 7. skum og mikrobærere kan derefter gradvist rehydreret og podet med celler. Repræsentative billeder vises af menneskelige ASC (levedygtige celler = grøn) podet på en DAT skum (til venstre) og DAT mikrobærer (til højre). Scale søjler repræsenterer 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ACE222.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alligator clip leads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;470149-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-amylase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101074694</td>
			<td>from Aspergillus aryzae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004251</td>
			<td>With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9879&#160;</td>
			<td>Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomilling system</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td>MM 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8624426</td>
			<td>For lyophilized ECM and bioscaffold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Hams</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6421</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-196-6</td>
			<td>Low form; volume range of 250 - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311425125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Greenfield Specialty Alcohols Inc.</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td>Absolute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>80150</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>37-501-32</td>
			<td>For transferring the foams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer ( -80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EXF40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26D</td>
			<td>To store lyophilized cryomilled ECM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held homogenizer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Speed: 8000 - 30,000 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-261-17</td>
			<td>10 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For electrospraying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750021</td>
			<td>FreeZone4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling chamber</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0213</td>
			<td>25 mL volume recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling balls</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16003-606</td>
			<td>10 mm diameter, stainless steel recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C ABD305185</td>
			<td>For dispensing ECM suspension into moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator shaker&#160;</td>
			<td>SciLogex</td>
			<td>832010089999</td>
			<td>Temperature controlled (37 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>Mandel Scientific</td>
			<td>DRU-4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470019-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21573-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309606</td>
			<td>3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 mL )</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (25 mL)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoopula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89259-968</td>
			<td>For collecting microcarriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10117-490</td>
			<td>Microprocessor controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Gamma High Voltage Research</td>
			<td>ES30P-5W/DDPM</td>
			<td>Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565321</td>
			<td>For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>22258092</td>
			<td>30 cm tubing length, 25 G 3/4 &#34; recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms

Cellefunktion medieres af interaktioner med den ekstracellulære matrix (ECM), som har komplekse vævsspecifik sammensætning og arkitektur. Fokus i denne artikel er på fremgangsmåderne til fremstilling ECM-afledte porøst skum og mikrobærere til anvendelse som biologisk relevante substrater i avanceret 3D in vitro cellekulturmodeller eller som pro-regenererende stilladser og celle afgivelsessystemer for vævskonstruktion og regenerativ medicin. Anvendelse decellulariseret væv eller oprenset uopløseligt collagen som et udgangsmateriale, kan teknikker anvendes til at syntetisere en bred vifte af vævsspecifikke bioscaffolds med tilpasselig geometrier. Den fremgangsmåde involverer mekanisk behandling og mild enzymatisk nedbrydning til en ECM suspension, der anvendes til at fremstille de tredimensionale skum eller mikrobærere gennem kontrollerede fryse- og lyofiliseringsprocedurerne. Disse rene ECM-afledte scaffolds er meget porøse, men stabil uden behov for chemical tværbindingsmidler eller andre additiver, som kan forringe cellefunktion. Stilladset egenskaber kan indstilles til en vis grad ved varierende faktorer såsom ECM suspension koncentrationen, mekaniske forarbejdningsmetoder eller syntesebetingelser. Generelt stilladserne er robuste og nemme at håndtere, og kan forarbejdes som væv til de fleste standard biologiske assays, hvilket giver en alsidig og brugervenlig 3D cellekultur platform, der efterligner den native ECM sammensætning. Samlet set kan disse enkle fremgangsmåder til fremstilling tilpassede ECM-afledte skum og mikrobærere være af interesse for både biologer og biomedicinske ingeniører som vævsspecifikke celle-lærerigt platforme til in vitro og in vivo anvendelser.

I den aktuelle undersøgelse, har vi fremstillet ECM-afledte skum og mikrobærere anvendelse af humant DAT, porcin DDT, og porcin DLV som repræsentative eksempler demonstrerer, at teknikkerne kan anvendes til at generere vævsspecifikke bioscaffolds anvendelse af en række decellulerede væv som ECM kilder ( figur 1). For både skum og mikrobærer fabrikation blev Nishihara teknikken med collagen solubilisering med den glycolytiske enzym α-amylase 37 indrettet til at frembringe en viskos ECM suspension fra decellulariseret væv udgangsmaterialer, som bruges til at syntetisere bioscaffolds gennem kontrollerede fryse- og lyofiliseringsprocedurerne. At fabrikere skummene kan de decellulariseret væv behandles via enten mekanisk hakket eller cryomilling at forøge overfladearealet før enzymatisk fordøjelse. Følge45; amylase behandling og homogenisering det resulterende ECM suspension dispenseret i et brugerdefineret støbeform, som derefter frosset og lyofiliseret. Skeletterne kan opbevares stabilt i tør tilstand i en længere periode. Før anvendelse i studier af cellekulturer, skal de lyofiliserede stilladser underkastes en kontrolleret rehydrering proces, der giver porøse og højt hydratiserede homogene skum afledt af ren ECM (figur 3A). Hvis skummene rehydratiseres for hurtigt, kan hurtig hævelse beskadige sarte strukturelle træk, hvilket resulterer i tab af integritet og sammenstyrtning. Generelt vil skummene bevare formen defineret af den oprindelige støbeform efter rehydrering og er stabile uden behov for kemisk krydsbinding. Figur 3B viser repræsentative scanning elektron mikroskop (SEM) billeder af DAT, DDT, og DLV skum fremstillet med cryomilled ECM ved en koncentration på 35 mg / mL og et frysepunkt på -80 &amp; #176; C. <img alt="figur 3" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" /> Figur 3. Repræsentative Billeder af DAT, DDT, og DLV Skum Færdige med Cryomilled ECM Suspensioner ved en koncentration på 35 mg / ml og frosset ved -80 ° C. A: Makroskopisk visning af DAT, DDT, og DLV formalet skum syntetiseret i en 48-brønds vævskulturplade skimmel efter rehydrering. Scale søjler repræsenterer 1 cm. B: SEM billeder af DAT, DDT, og DLV skum udviser en homogen porøs ultrastruktur. Scale søjler repræsenterer 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> De cryomilled ECM suspensioner kan også anvendes til at danne rene ECM-afledte mikrobærere via elektrospraying teknikker (figur 2 </strong&gt;). For hvert ECM kilde, suspensionskoncentrationen, nåletykkelse, infusionshastighed, og spændingen kan indstilles til at frembringe diskrete sfæriske mikrobærere i området fra 350 - 500 um i diameter efter kontrolleret rehydrering (figur 4A). Mens mikrobærerne kan opbevares i en frysetørret tilstand, anbefales for at lette håndtering, at de udleveres eller sigtes til en ønsket størrelsesområde efter resuspendering i ethanol. SEM imaging foreslår, at mikrobærer ultrastruktur kan variere afhængigt af decellulerede vævskilde (figur 4B). <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" /> Figur 4. Repræsentative Billeder af DAT, DDT, og DLV Mikrobærere Færdige med Cryomilled ECM Suspensioner ved en koncentration på 35 mg / ml, en infusionshastighed på 0,5 ml / min, og en påtrykt spænding på 20 kV. A: Makroskopisk udsigt of de hydrerede DAT, DDT, og DLV mikrobærerne. Scale søjler repræsenterer 4 mm. B: SEM billeder af DAT, DDT, og DLV mikrobærere der viser, at ultrastruktur og størrelse kan variere afhængigt af ECM kilde. Scale søjler repræsenterer 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> De mekaniske egenskaber af stilladser er afhængige af ECM kilde, fremgangsmåden til behandling anvendt (dvs. hakning versus cryomilling), koncentration ECM suspension og frysepunkt. Generelt stilladserne er bløde og eftergivende, med Youngs moduler i området fra 1 - 5 kPa rapporteret for DAT (50 &amp; 100 mg / ml) 29 og DLV skum (20 - 50 mg / ml) 31, og &lt;1 kPa for mikrobærerne. De cryomilled skum er typisk blødere then hakket skum på grund af deres mere forstyrret naturen. Specialiserede mekaniske testsystemer udstyret med yderst følsomme vejeceller er behov for nøjagtig karakterisering af trykegenskaber. Typisk vil de skum og mikrobærerne har lavere moduler end de native decellulariserede væv på grund af de yderligere behandlingstrin, der indgår i fremstillingen, herunder enzymatisk fordøjelse og homogenisering, såvel som den ikke-kovalent tværbundet karakter skeletterne. Dette kan dog variere afhængigt af vævet af interesse. For eksempel i tidligere arbejde, fandt vi, at hakket DAT skum fremstillet ved høj ECM koncentrationer (100 mg / ml) havde lignende moduler til nativt fedtvæv 29. De rehydrerede ECM-afledte skum og mikrobærere kan podes med celler under statiske eller dynamiske dyrkningsbetingelser til tilvejebringelse af en celle understøttende platform til in vitro studier af cellekulturer og / or in vivo celle levering. Mens stilladser støtter generelt cellebinding, vil seeding effektivitet afhænger af ECM kilde, stilladset geometri og porøsitet og celletypen af ​​interesse. Som sådan vil de seeding metoder og tætheder kræver optimering afhængigt af brugerdefinerede tilstande. For skummene beskrevet ovenfor, anbefaler vi et udgangspunkt cellekoncentration i området fra 0,25 - 1 x 10 6 celler / stillads, med dynamisk podning på en orbitalryster at forbedre celleinfiltration. For mikrobærerne, foreslår vi en indledende udsåningstæthed i intervallet 25.000 - 50.000 celler / mg af mikrobærere, med podning udføres under dynamiske forhold i en spinner dyrkningskolbe 11. De viste ved bunden af figur 1 billeder repræsenterer humane ASC&#39;er podet på en DAT skum (venstre) eller DAT mikrobærer (højre, formærket med en amin-reaktivt farvestof, og som optræder blå 13), som visualiseret ved konfokal mikroscopy anvendelse af et fluorescerende levedygtighed cellefarvende (levende celler = grøn, døde celler = rød; Scale søjler repræsenterer 100 um). Konfokal mikroskopi kan anvendes til at visualisere celler podet på overfladen af ​​skum op til 2 mm i tykkelse, men visualisering i de centrale regioner i stilladserne er begrænset af deres uigennemsigtige natur. Imidlertid kan skummene og mikrobærere behandles som væv og paraffinindlejret eller cryo-snit til histologisk og immunhistokemisk analyse at visualisere cellefordeling og markør-ekspression.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms at JoVE.com

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Den vævsspecifikke ekstracellulær matrix (ECM) er en vigtig mediator af cellefunktion. Denne artikel beskriver fremgangsmåder til syntetisering af rene ECM-afledte skum og mikrobærere, som er stabile i kultur uden behov for kemisk tværbinding til applikationer i avanceret 3D in vitro cellekulturmodeller eller som pro-regenererende bioscaffolds.

Fabrikation af ekstracellulære matrix-afledte Skum og Mikrobærere som Tissue-specifikke cellekultur og Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Roterende Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human trofoblasten celler som en model

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Selvrapportering Stilladser for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Cell Klemme som en robust, Mikrofluid Intracellulær Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Mesenchymale stromacelle Kultur og Levering i Autologe Betingelser: En smart tilgang til Ortopædisk Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Tunable Hydrogeler fra Pulmonal ekstracellulære matrix for 3D cellekultur

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Syntese af Biokompatible Liquid Crystal Elastomer Skum som Cell Stilladser til 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Sammenlignelige Decellularization af føtale og voksne hjerte væv Explants som 3D-lignende platforme til i Vitro undersøgelser

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Rekombinant kollagen I peptid Microcarriers for celle ekspansion og deres potentielle anvendelse som celle levering System i en bioreaktor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Opdigte en nyre Cortex ekstracellulære Matrix-afledte Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...