Name: fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms at JoVE.com

The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.

1. décellularisé Traitement des tissus <ol><li> Décellularisation et Lyophilisation <ol><li> Decellularize tissu (s) d&#39;intérêt suivant un protocole établi. NOTE: Échafaudage dans l&#39;étude ont été préparés selon les protocoles de décellularisation publiés pour DAT humain 28, DDT porcine 8 et porcine DLV 32. , Le collagène insoluble disponible dans le commerce peut également être utilisé pour fabriquer des mousses et des microsupports, tels que le collagène de tendon bovin source, qui a été utilisé avec succès sur une plage de concentration de 10-50 mg / mL. D&#39;autres sources de collagène insolubles peuvent être utilisés, mais peuvent nécessiter l&#39;optimisation pour identifier la plage de concentration qui donnera échafauds stables. </li><li> Transférer le tissu décellularisé hydraté ou de collagène purifié dans un tube de centrifugation de 50 mL avec une pince et ajouter suffisamment d&#39; eau distillée deux fois (ddH 2 O) pour immerger le tissu, toa volume total maximum de 35 ml. </li><li> Congeler l&#39;échantillon pendant une nuit à -80 ° C, avec le tube de centrifugeuse en position horizontale pendant la congélation afin de maximiser la surface de sublimation lors de la lyophilisation subséquente. </li><li> Retirez le bouchon du tube de centrifugeuse et transférer l&#39;échantillon congelé dans un bocal de lyophilisation. </li><li> Lyophiliser l&#39;échantillon en utilisant un lyophilisateur de laboratoire pendant 48 - 72 h ou jusqu&#39;à séchage complet. REMARQUE: Le temps de séchage peut varier selon les différents tissus et lyophilisateurs décellularisé. </li><li> Hacher finement l&#39;ECM lyophilisée en petits morceaux (environ 1 - 2 mm 3) à l&#39; aide des ciseaux chirurgicaux tranchants. </li><li> Conservez l&#39;ECM émincé dans un dessicateur avant d&#39;être prêt pour un traitement ultérieur. NOTE: Il est recommandé que l&#39;ECM émincé être utilisé immédiatement pour empêcher l&#39;absorption d&#39;humidité de l&#39;environnement. </li></ol></li><li> Cryobroyage (facultatif pour la fabrication de mousse) <ol><li> Remplir une chambre de broyage en acier inoxydable de 25 ml pour un Laboratory système de broyeur à boulets avec ECM lyophilisé haché et ajouter deux billes de broyage en acier inoxydable de 10 mm. </li><li> Fermer et submerger complètement la chambre de broyage chargé dans l&#39;azote liquide pendant 3 minutes. </li><li> Mill le échantillon congelé pendant 3 min à 30 Hz (1800 tours par minute). </li><li> Répétez les étapes 1.2.2 et 1.2.3 jusqu&#39;à ce que l&#39;ECM est broyé en une poudre fine. NOTE: Le nombre de fois que ces étapes doivent être répétées peuvent varier entre les sources d&#39;ECM. Par exemple, DAT nécessite généralement 3 cycles de fraisage pour produire une poudre fine. </li><li> Transférer la poudre à l&#39;aide d&#39;un scoopula dans un flacon en verre, sceller hermétiquement et stocker dans un dessiccateur. </li></ol></li><li> Préparation de la suspension ECM <ol><li> Peser 250 mg de soit hachée (pour les mousses) ou cryomilled (pour des mousses ou des microporteurs) ECM et la transfère dans un tube à centrifuger de 15 mL. Reportez-vous à l&#39;étape 1.1.6 et la section 1.2 pour la préparation de l&#39;ECM émincé et cryomilled ECM, respectivement. NOTE: Ce protocole est conçu pour préparer un 50 mg / mL ECM suspension, qui est recommandé pour les DAT humain, le DDT porcine et DLV porcine. En fonction de la source particulière d&#39;ECM, des suspensions uniformes peuvent être produites à des concentrations de départ supérieures ou inférieures. </li><li> Ajouter 5 ml de 0,22 M de NaH 2 PO 4 (pH 5,4) tampon sur le tube de centrifugeuse et marquer le niveau de liquide sur le tube. </li><li> Préparer une solution mère α-amylase en ajoutant 7,5 mg d&#39;α-amylase à 1 ml de 0,22 M de tampon NaH 2 PO 4 (pH 5,4). Ajouter 100 ul de l&#39;α-amylase solution mère (0,75 mg d&#39;α-amylase, de 0,3% en poids / poids de tissu sec) de l&#39;échantillon. Ajouter 0,22 M NaH 2 PO 4 pour obtenir un volume final de 10 ml. </li><li> Agiter la suspension en continu à 300 tpm pendant 72 h à température ambiante. </li><li> Centrifuger la suspension à 1500 g pendant 10 min. Recueillir soigneusement et jeter le surnageant sans perturber le culot de digérées ECM. Remettre en suspension le matériau en pastilles dans 10 ml de NaCl à 5% dilué dans ddH 2 O. </li><li> Répétez l&#39; étape 1.3.5 pour un total de deux rinçages avec 5% de NaCl dans ddH 2 O. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le matériau en pastilles dans 10 ml de ddH 2 O. </li><li> Agiter la suspension en continu à 300 tours par minute pendant 10 minutes à température ambiante. </li><li> Centrifuger la suspension à 1500 g pendant 10 min. Recueillir soigneusement et jeter le surnageant sans perturber le culot de digérées ECM. </li><li> Ajouter 0,2 M d&#39;acide acétique à la marque 5 mL faite à l&#39;étape 1.3.2. </li><li> Agiter la suspension en continu à 120 rpm O / N à 37 ° C. </li><li> Homogénéiser la suspension de l&#39;ECM à la température ambiante en dix secondes d&#39;intervalle à l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur à main équipé d&#39;une sonde large en dents de scie de 10 mm jusqu&#39;à ce qu&#39;il ne reste fragments visibles. Placez la suspension dans un bécher d&#39;eau froide entre les intervalles d&#39;homogénéisation pour éviter la surchauffe. NOTE: En fonction de la source d&#39;ECM, la dilution ultérieure dans de l&#39;acide acétique 0,2 M peut être nécessaire pour obtenir une suspension homogène. Erefroidissement de la suspension xcessive ECM peut entraîner une augmentation de la viscosité qui peut interférer avec une homogénéisation efficace. Si une augmentation de la viscosité est constatée, l&#39;échantillon peut être réchauffé à 37 ° C et soumis à un traitement ultérieur. </li><li> Conserver à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un mois avant la fabrication de la mousse ou microsupport. </li></ol></li></ol> 2. Fabrication de mousse dérivé ECM- <ol><li> Incuber la suspension provenant de l&#39;étape d&#39;ECM 03/01/13 (hachée ou cryomilled) à 37 ° C sous agitation continue à 120 rpm jusqu&#39;à ce que la suspension est chaud. </li><li> Diluer la suspension de l&#39;ECM dans 0,2 M acide acétique à la concentration désirée. REMARQUE: En fonction de la source d&#39;ECM, des mousses stables peuvent être préparés dans la gamme de 10-100 mg / ml, avec 15-50 mg / mL la plage recommandée pour les DAT, le DDT et DLV. En général, les mousses fabriquées à des concentrations plus élevées seront légèrement moins poreux mais plus stable en culture et plus facile à manipuler. </li><li> En utilisant une seringue de 3 ml wvec une aiguille 18 G pour empêcher la formation de bulles dans la suspension de l&#39;ECM, remplir le moule souhaité avec la suspension de l&#39;ECM. Pour fabriquer le DAT, le DDT et les mousses DLV, dispenser 400 pi de 35 mg / ml de suspension de l&#39;ECM dans une plaque traitée de la culture de cellules à 48 puits. REMARQUE: La forme du moule sélectionné et le volume de suspension ECM déterminent la géométrie de la mousse résultante. </li><li> Couvrir et congeler les moules pendant la nuit en les plaçant dans un -20 ° C ou -80 ° C congélateur. NOTE: La température de congélation peut affecter la porosité des mousses. Pores plus grands sont attendus lorsque les échantillons sont congelés à -20 ° C par rapport à -80 ° C due à la formation de gros cristaux de glace 33. Pour fabriquer des mousses ayant une structure poreuse uniforme, en sorte que le moule ne sont pas en contact avec une surface conductrice pour éviter un refroidissement directionnel. </li><li> Placez les moules contenant les échantillons congelés dans un flacon de lyophilisateur. Connecter le ballon lyophilisateur au laboratSystème de ory lyophilisateur et sèche pendant 24 h. NOTE: Il est important que l&#39;échantillon reste congelé avant la lyophilisation. </li><li> Conserver les mousses lyophilisées dans un dessicateur jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> 3. microsupports dérivé ECM-fabrication par électronébulisation NOTE: Une vue d&#39; ensemble de l&#39;électronébulisation mis en place est illustré à la figure 2. <ol><li> Incuber la suspension ECM cryomilled de l&#39;étape 01/03/13 à 37 ° C sous agitation continue à 100 rpm O / N. REMARQUE: Cryomilled ECM est utilisé pour fabriquer les microporteurs dérivés ECM pour assurer une plus grande uniformité dans la suspension et empêcher l&#39;obstruction pendant électropulvérisation. </li><li> Charge 3 ml de suspension ECM dans une seringue Luer Lock 3 ml et joindre une perfusion à ailes fixé sur l&#39;alésage de la seringue. NOTE: Une gamme de calibres d&#39;aiguille peut être utilisée, en reconnaissant que la sélection peut influer sur la taille et la forme des microsupports résultants. pour fabricate les DAT, DDT, et DLV microsupports, en utilisant une aiguille 25 G. </li><li> Fixer la seringue à l&#39;intérieur de la pompe à seringue. Fixer l&#39;aiguille à une position de stérilisation et de positionner la pointe de l&#39;aiguille verticalement à une distance de 4 - 6 cm à partir du sommet d&#39;un flacon Dewar de forme basse (250 - 500 mL gamme de taille recommandée). </li><li> Attacher une électrode de pince crocodile à la pointe de l&#39;aiguille et le connecter à la borne positive de l&#39;alimentation à haute tension. </li><li> Plier une bande de feuille d&#39;aluminium (12 x 5 cm) au-dessus du bord de la fiole à vide. </li><li> Attacher une seconde électrode de pince crocodile à l&#39;arête extérieure de la feuille et le connecter à la borne de source de masse de l&#39;alimentation électrique. </li><li> Remplir le vase Dewar à azote liquide à environ 1 cm à partir du haut, de sorte que les ¾ de la feuille est immergée. NOTE: Il est important de garder le flacon Dewar rempli d&#39;azote liquide. La surface de l&#39;azote liquide ne doit pas être inférieure à 2 cm de la partie supérieure du ballon pendant le procès d&#39;électronébulisations. le remplissage en continu de l&#39;azote liquide est nécessaire pour maintenir un niveau constant pendant électronébulisation. </li><li> Régler la pompe de seringue à un débit de perfusion de 30 ml / h. REMARQUE: Varier le débit de perfusion peut modifier la forme de microporteurs et le diamètre, mais la plage recommandée est de 25 - 35 ml / h. Bien qu&#39;il dépend fortement de la viscosité de la suspension, des débits inférieurs à 25 ml / h peut entraîner la production de microporteurs plus grandes. Très faibles débits, la taille et la forme des microporteurs peuvent devenir moins homogènes. A taux de perfusion de plus de 35 ml / h, l&#39;uniformité des gouttelettes générées par électronébulisation peut être perturbée, ce qui entraîne des microsupports non sphériques avec une distribution plus large de taille 34. </li><li> Appliquer une tension de 20 kV et de mettre en marche la pompe à seringue pour initier électronébulisation. REMARQUE: La tension peut être modifiée pour régler la taille des microsupports et a tendance à avoir un plus grand impact sur le diamètre que le Infusiotaux n. La plage de tension recommandée est de 15-25 kV. Une diminution du diamètre de microsupport est prévu avec une augmentation de la tension 35. </li><li> Une fois l&#39;infusion terminée, versez avec précaution l&#39;excès d&#39;azote liquide du Dewar, laissant les microporteurs en suspension dans ~ 25 ml d&#39;azote liquide pour assurer qu&#39;ils restent gelés. </li><li> Transférer immédiatement les microsupports avec l&#39;azote liquide dans un tube à centrifugation de 50 ml en versant dans un mouvement sans heurt. Recueillir les microporteurs congelés restant dans le Dewar avec un scoopula et les ajouter au tube de centrifugeuse. REMARQUE: En fonction de la taille du Dewar, microsupports dans l&#39;azote liquide peut être initialement versé dans un récipient de taille moyenne, puis transféré immédiatement dans le tube de centrifugation de 50 ml. </li><li> Couvrir le tube de centrifugation contenant les microsupports dans de l&#39;azote liquide avec une feuille d&#39;aluminium perforée de petits trous dans la préparation pour la lyophilisation. </li><li> Placez la centrifugeuse couvertetubes dans un flacon de lyophilisation. connecter immédiatement la fiole sur le lyophilisateur et sécher les échantillons O / N. NOTE: Il est très important de garder les microporteurs en suspension dans de l&#39;azote liquide pour assurer qu&#39;ils ne dégèlent pas avant cette étape, car la décongélation peut entraîner l&#39;effondrement et / ou l&#39;agrégation. DAT, DDT et DLV microsupports fabriqués à une concentration de 35 mg / ml en utilisant les conditions décrites ci-dessus électronébulisation auront typiquement un diamètre hydraté comprise entre 350 à 500 um. La distribution de taille peut varier en fonction de la source d&#39;ECM. </li><li> Conserver les microporteurs lyophilisés dans un dessicateur jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig2.jpg" /> Figure 2. Vue d&#39; ensemble de l&#39;appareil électropulvérisation utilisé dans la fabrication microsupports. A: Image montrant la disposition de la clé de l&#39; équipement électronébulisation comprenant la pompe à seringueet l&#39;alimentation haute tension, ainsi que le positionnement de l&#39;aiguille par rapport au Dewar d&#39;azote liquide. B: électronébulisation schématique, y compris les plages recommandées pour la tension, la vitesse de perfusion, et la distance. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 4. Préparer Mousses et microsupports pour la culture cellulaire <ol><li> réhydratation <ol><li> Transférer les mousses lyophilisées avec des pinces dans un tube à centrifugation de 50 ml contenant un excès d&#39;éthanol absolu (~ 99,9%) (~ 5: 1 d&#39;éthanol à des mousses). De même, les remettre en suspension les microsupports lyophilisée dans un excès d&#39;éthanol absolu dans le tube de centrifugeuse d&#39;origine utilisé pour la collecte. En utilisant une pipette sérologique, filtrer les microsupports à travers un tamis inoxydable avec une taille de maille définie dans un nouveau tube de centrifugation de 50 ml pour éliminer tous les agrégats et sélectionner des plages de tailles souhaitées. NOTE: Si les mousses sont fabriquées dans les plaques EPTC, ils peuvent être réhydratés directement au sein de ces navires. </li><li> Incuber à 4 ° C pendant 4 heures ou jusqu&#39;à ce que les mousses ou les microsupports ont gravité déposé au fond du tube de centrifugation. Effectuez toutes les étapes suivantes dans une hotte à flux laminaire en utilisant des réactifs stériles et une technique aseptique appropriée. </li><li> Éliminer l&#39;éthanol absolu en utilisant une pipette sérologique et ajouter un excès (5: 1 rapport) 95% d&#39;éthanol dilué avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à l&#39;échafaudage. Incuber à 4 ° C pendant 4 heures ou jusqu&#39;à ce que les échafauds dérivé ECM ont coulé au fond du récipient de réhydratation. </li><li> Peu à peu réhydrater les échafauds à travers une série d&#39;éthanol (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 et 0%, dilué avec du PBS stérile). A chaque étape, incuber à 4 ° C jusqu&#39;à ce que les échafaudages ont coulé au fond du récipient avant de changer la solution. Dégazer les échafauds sous vide de lumière si la formation de bulles à l&#39;intérieur de l&#39;échafaudage est obsdé- laissées. </li><li> Remplacer le PBS stérile pour deux rinçages supplémentaires pour éliminer l&#39;éthanol résiduel. </li><li> Conserver dans 100% PBS stérile à 4 ° C jusqu&#39;à la culture cellulaire. Utilisez les échafauds dans 1 - 2 semaines après réhydratation. </li></ol></li><li> Préparation de l&#39;ensemencement des cellules <ol><li> Le jour avant l&#39;ensemencement, transférer les mousses à l&#39; aide de forceps dans la culture cellulaire bien traités plaques ou inserts Transwell et ajouter du milieu de culture cellulaire suffisante (choisie en fonction du type cellulaire d&#39;intérêt) pour submerger complètement les échafauds (par exemple, 2,5 ml / Échafaudage une plaque de 12 puits). De même, les microsupports permettent à la gravité se déposent à l&#39;intérieur du tube de centrifugation, retirer avec soin le PBS en utilisant une pipette sérologique sans déranger les microsupports, et ajouter du milieu de culture cellulaire pour obtenir un rapport de 5: 1 de milieu pour les microporteurs. NOTE: Pour l&#39;ensemencement ASCs humaines, utiliser Modified Dulbecco milieu d&#39;Eagle (DMEM): le mélange nutritif F12 de Ham complété par10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine. </li><li> Remplacez le milieu de culture cellulaire pour un total d&#39;un rinçage. </li><li> Equilibrer pendant la nuit des échafaudages dans un milieu de culture de cellules à 37 ° C. Les échafauds seront prêts pour l&#39;ensemencement cellulaire le lendemain. NOTE: Les mousses peuvent être statiquement tête de série dans des inserts de culture cellulaire ou des plaques de puits de culture de tissus 29 ou dynamique tête de série à l&#39; aide d&#39; un agitateur de laboratoire 36. En fonction de la source d&#39;ECM, des méthodes de traitement et de concentration de la suspension, l&#39;ensemencement dynamique peut améliorer la fixation des cellules initiale, la prolifération et l&#39;infiltration. Les microporteurs peuvent être ensemencées dynamiquement en utilisant un système de culture de filage 11. </li></ol></li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

En général, bioscaffolds dérivés de tissus décellularisé permet de rapprocher la composition 3D complexe et la structure de l&#39;ECM dans le microenvironnement cellulaire natif par rapport aux échafauds synthétiques ou des modèles de culture standard basés sur EPTC 2D. Comme indiqué précédemment, les interactions ECM cellulaire sont d&#39;une importance cruciale dans la médiation de comportement cellulaire à la fois dans la culture et dans le corps 1. Reconnaissant que les propriétés biochimiques, biophysiques et biomécaniques de l&#39;ECM sont uniques à chaque tissu, il augmente preuves à l&#39;appui les raisons pour appliquer des approches spécifiques des tissus dans la conception de biomatériaux pour l&#39;ingénierie tissulaire, ainsi que dans le développement de plus modèles de culture physiologiquement pertinents pour les expériences in vitro 20. En utilisant les tissus décellularisé comme matériau de départ, nos méthodes peuvent incorporer la composition complexe de l&#39;ECM spécifique au tissu dans plus Custformats d&#39;échafaudage omizable. Bien que les étapes de traitement mécanique et enzymatique se traduira par une perte de l&#39;indigène ECM ultrastructure, des études antérieures avec DAT ont démontré que les effets instructifs de l&#39;ECM dérivées du tissu adipeux sont conservés dans ces formats d&#39;échafaudage, ce qui suggère que la composition de bioscaffold est un médiateur clé de la fonction des cellules 11, 29. Un avantage significatif de l&#39;utilisation des mousses dérivées ECM et microsupports en tant que substrats de culture de cellules en comparaison avec les tissus décellularisés intacts est qu&#39;ils sont plus homogènes, ce qui peut améliorer l&#39;uniformité de la distribution cellulaire et les interactions ECM cellules de cellule à cellule /. Les méthodes décrites ici peuvent être utilisés pour générer un large éventail de bioscaffolds spécifiques de tissus destinés à être utilisés dans la culture cellulaire et les applications de l&#39;ingénierie tissulaire. Par exemple, en plus du DAT, le DDT et DLV, notre laboratoire a appliqué avec succès ces techniques pour générer por 3Dmousses UO os à l&#39;aide de décellularisé, du cartilage, noyau pulpeux et l&#39;anneau fibreux, ainsi que, le collagène insoluble disponible dans le commerce dérivé de tendon bovin. De in vitro perspective, ces bioscaffolds pourraient être utilisés comme base de plus haute fidélité-modèles de culture 3D pour étudier la biologie cellulaire, la physiologie ou la pathologie de la maladie 38, comme substrats bioactifs dans les plates - formes de criblage de médicaments à haut débit 39, ou comme matrices instructives pour la tige la différenciation des cellules 40, 41. DAT, DDT et mousses fabriquées DLV à des concentrations de 25 - 50 mg / mL sont stables à long terme en culture in vitro (testé jusqu&#39;à 28 jours). De plus, les trois types de microsupports peuvent supporter la fixation et la prolifération cellulaire dans des conditions dynamiques dans un système de culture centrifuge à faible cisaillement (10 - 15 rpm) pendant au moins 2 semaines. Pour les applications in vivo, biocompatible et biodegradables mousses dérivées ECM et microporteurs prometteurs en tant que produits impromptu pour stimuler le remodelage tissulaire constructif et la régénération 11, 29. En outre, les échafaudages-adhésifs cellulaires peuvent être utilisés comme systèmes de délivrance de thérapie cellulaire 42, 43. A titre d&#39;exemple, les mousses DAT ont été montrés pour favoriser l&#39; angiogénèse et l&#39; adipogenèse quand ensemencé avec allogéniques et ASCs implanté sous - cutanée dans un modèle de rat immunocompétent 29. Par rapport à la DAT intacte, plus DAT hautement transformés mousses dégradé beaucoup plus rapidement, avec une réduction de 50% en volume noté à 3 semaines, ils se sont intégrés avec les tissus hôtes, et presque la résorption complète de 12 semaines. Cependant, les mousses ont également induit une réponse angiogénique plus puissant, ce qui suggère que l&#39;ECM digéré enzyme a des effets uniques pro-régénération. De même, les microsupports dérivé ECM peuvent être utilisées in vitro comme &lt;/ em&gt; substrats de culture de cellules dans les systèmes de culture dynamique et en tant que véhicules de délivrance injectable de cellules 11, 30, 44. Plus précisément, le petit diamètre et une grande aire de surface des microsupports peut permettre la délivrance d&#39;une grande quantité de cellules dans un petit volume, tout en fournissant une matrice qui peut aider à soutenir la viabilité cellulaire et augmenter la rétention des cellules au site d&#39;injection 30. Avant l&#39;utilisation dans un système vivant, il est essentiel de veiller à ce que l&#39;ECM source est sensiblement dépourvu de composants cellulaires antigéniques et / ou des réactifs de décellularisation potentiellement cytotoxiques qui pourraient déclencher une réponse négative hôte 7. L&#39;enzyme pepsine protéolytique est couramment utilisé dans la préparation d&#39;hydrogels dérivés ECM-15. La pepsine est une protéase non spécifique qui digère collagène et d&#39;autres protéines ECM into 45 petits fragments. Alors que les hydrogels fabriqués à partir de l&#39; ECM pepsine digéré ont été rapportés d&#39;avoir des effets cellulaires instructifs, une limitation est que ces matériaux ont tendance à être extrêmement faible résistance mécanique 46. Dans notre développement initial des DAT microporteurs, nous avons utilisé une approche composite dans laquelle DAT digéré pepsine a été combiné avec de l&#39; alginate et a ajouté goutte à goutte en CaCl 2 pour former des billes sphériques 30. Les billes ont ensuite été photo-réticulée et l&#39;alginate a été extraite en utilisant du citrate de sodium. En plus de l&#39;exigence de réticulation chimique, une limitation clé est que les microporteurs fabriqués avec cette approche ont une mauvaise stabilité ci - dessous une taille de 900-950 um 30. A la place de la pepsine, les méthodes présentées ici utilisent une digestion plus légère de l&#39;ECM avec l&#39;enzyme glycolytique α-amylase, qui est postulée à cliver les groupes hydrates de carbone de la telopeptide régions de collagène, ce qui augmente la solubilité dans l&#39; acide acétique 37. Cette approche permet l&#39;isolement de collagène hautement polymérisé qui peut être utilisé pour générer des pures mousses dérivées ECM et microporteurs sans la nécessité d&#39;une réticulation chimique ou d&#39;autres additifs. Ces bioscaffolds sont stabilisées par des interactions physiques et de liaisons hydrogène entre les fibrilles de collagène bien conservés, similaire au collagène natif dans le microenvironnement ECM. Les mousses sont une plate-forme hautement flexible qui peut être fabriquée dans une grande variété de géométries en fonction du moule spécifique sélectionné. Pour les études de culture cellulaire, les mousses peuvent être coulés directement dans des plaques à puits EPTC, pour former des revêtements ou des échafaudages 3D d&#39;épaisseur variable. Pour fabriquer des mousses 3D avec des surfaces très uniformes, il est recommandé d&#39;utiliser un moule personnalisé est conçu qui peut être scellé sur les deux faces avec des lames en plastique ou en verre. Soit ECM ou émincé cryomilled peut être utilisé pour synthétiserles mousses. En général, nous avons constaté que les mousses cryomilled ont tendance à être plus doux et macroscopiquement un ultrastructure plus perturbé à des concentrations inférieures 31, 36. En fonction de la source de tissu, les étapes de traitement mécanique supplémentaire peut provoquer des altérations dans la composition d&#39;ECM qui pourraient influer sur la fonction cellulaire. Par exemple, dans nos précédents travaux, la laminine a été détectée dans les mousses de DLV émincés, mais pas cryomilled mousses DLV 31. En revanche, le collagène I, le collagène IV, la laminine, la fibronectine et ont été détectés dans les deux hachées et cryomilled DAT 36 mousse. En plus des étapes de traitement mécanique, la porosité et la taille des pores des mousses peut être réglé dans une certaine mesure en faisant varier la concentration de la suspension de l&#39; ECM et la température de congélation 47. En général, les mousses de concentration plus faible (~ 10 - 15 mg / ml) sont qualitativement plus poreuses, mais peuvent contracter rapidement et ont une mauvaisela stabilité dans la culture à long terme 31, 36. De même, un taux de congélation lente, typiquement obtenu par une température de congélation plus élevée, peut donner lieu à de plus grands pores des mousses en raison de la taille des cristaux de glace formés pendant la fabrication 29. Tous ces paramètres peuvent influencer les interactions cellulaires avec les matériaux, y compris la fixation, l&#39;infiltration et le remodelage. Par exemple, la croissance cellulaire sur des mousses qui sont fabriqués avec des concentrations plus élevées de l&#39; ECM peut être limitée à des zones de surface, en particulier avec des sources d&#39;ECM hachées et dans des conditions de culture statique 36. Pour les microporteurs, les paramètres clés qui peuvent être réglés sont la concentration de la suspension de l&#39;ECM, la jauge d&#39;aiguille, et la tension appliquée, avec des concentrations plus élevées produisant généralement des microsupports qui sont plus stables en culture dynamique à long terme. Après l&#39;ouverture de électronébulisation, l&#39;ECM suspension gouttelettes devraient rapidement tomber dans le centre du ballon, en direction du collecteur de feuille d&#39;aluminium. Pour empêcher l&#39;agrégation, il est important que les billes en contact avec l&#39;azote liquide avant de la feuille. La distance entre l&#39;aiguille et la surface de l&#39;azote liquide peut être ajustée pour satisfaire à ces exigences. Il est important de noter que l&#39;optimisation peut être nécessaire en fonction des propriétés de chaque source spécifique d&#39;ECM, en particulier dans le choix de la plage de concentration qui va générer bioscaffolds stables. Un autre facteur clé est le protocole de décellularisation qui est utilisé pour générer les matières de départ, comme les méthodes de décellularisation qui dégradent l&#39;ECM ou la présence de réactifs résiduels (par exemple, des agents tensioactifs) peuvent avoir un impact négatif sur la stabilité des mousses résultantes et des microsupports. Si les défis sont rencontrés avec la stabilité des bioscaffold, des options qui peuvent être étudiés comprennent l&#39;utilisation d&#39;un processus de réhydratation plus progressive, l&#39;augmentation de l&#39;ECM suspconcentration ension et exploring émincé par rapport cryomilled ECM. Si toutes ces options ne parviennent pas à résoudre le problème, il peut être nécessaire d&#39;envisager d&#39;autres protocoles de décellularisation ou des sources d&#39;ECM. Pour assurer la reproductibilité lors de la production d&#39;échafaudage, il faut prendre un soin particulier à certaines étapes du protocole. Lorsque cryobroyage les tissus décellularisés, il est recommandé que le broyage soit effectué immédiatement après lyophilisation dans un environnement sec afin de réduire la probabilité d&#39;agrégation des particules due à l&#39;absorption de l&#39;humidité de l&#39;environnement. Lors de la fabrication microcarrier, il est suggéré que la suspension est électropulvérisée en petits lots, avec un volume maximum de 3 ml, pour éviter les problèmes avec le refroidissement de l&#39;échantillon qui peut entraîner l&#39;obstruction de l&#39;aiguille. En outre, il est essentiel que les microporteurs ne sont pas autorisés à dégeler après le processus de électronébulisation. Pour maintenir leur géométrie sphérique et la stabilité mécanique, la microcarriteurs doivent être recueillies à partir de l&#39;azote liquide, transporté dans un récipient rempli d&#39;azote liquide, et on le lyophilise immédiatement. Enfin, pour les mousses et microporteurs, il est essentiel que les étapes de réhydratation sont effectuées lentement sur une période de plusieurs jours. réhydratation rapide peut conduire à l&#39;effondrement structurel sur la macro- et / ou micro-échelle. En outre, la réhydratation doit se produire lentement pour éviter la formation de petites bulles d&#39;air au sein de l&#39;échafaudage, ce qui peut nécessiter une quantité importante de temps pour dégazer sous vide léger. En conclusion, les méthodes présentées dans le présent document peuvent être utilisés pour fabriquer un large éventail de mousses spécifiques de tissu et comprenant des microsupports ECM pur, non-réticulé chimiquement. Un avantage pour les chercheurs biologiques est que les bioscaffolds sont faciles à manipuler et peuvent être traitées de façon similaire aux tissus lors de l&#39;exécution des analyses avec des techniques telles que histologie, immunohistochimie, ou d&#39;un gène et des analyses d&#39;expression de protéines.En outre, les échafauds dérivés ECM peuvent être dégradés par voie enzymatique pour extraire les populations de cellules ensemencées ou peuvent être utilisés directement en tant que véhicules de livraison de cellules biodégradables et biocompatibles. Dans l&#39;ensemble, cette technologie de plate-forme flexible possède une grande utilité pour de nombreuses applications, notamment pour les études de culture cellulaire 3D enquête fonction cellulaire, comme substrats d&#39;expansion cellulaire, et comme bioscaffolds pro-régénération.

La matrice extracellulaire (ECM) est constitué d&#39;un réseau complexe en 3D des protéines, des glycoprotéines et des polysaccharides 1. Une fois considéré comme un cadre principalement de structure, il est maintenant bien admis que l&#39;ECM comprend un large éventail de molécules bioactives avec des rôles fonctionnels importants 2. Interactions cellule-ECM peuvent diriger la survie cellulaire, l&#39; adhérence, la migration, la prolifération, la différenciation et 3. Alors que les grandes classes de macromolécules ECM sont généralement bien conservés dans les tissus et les espèces, chaque tissu a une composition de matrice unique et l&#39; architecture 4. Dans l&#39; ensemble, l&#39;ECM spécifique du tissu fournit un microenvironnement instructif qui médiatise fonction du subcellulaire à l&#39;échelle du tissu / organe 5. En raison du rôle critique de l&#39;ECM dans la médiation de la fonction cellulaire, on a un intérêt croissant pour le developpement de bioscaffolds dérivé ECM pour les applications en génie tissulaire et la médecine régénérative. En particulier, le procédé de décellularisation a été largement explorée comme un moyen d&#39;obtenir ECM à partir d&#39; une large gamme de tissus destinés à être utilisés en tant que matériau d&#39;échafaudage pour la régénération tissulaire et la livraison des cellules 5, 6, 7. Décellularisation comprend généralement une série d&#39;étapes de traitement mécanique, chimique et / ou biologiques visant à éliminer les cellules et les composants cellulaires, tout en provoquant des altérations minimes idéalement à la structure 3D et la composition de l&#39;ECM 8. Grâce à l&#39; arpentage de la littérature, divers protocoles de décellularisation peuvent être identifiés pour pratiquement tous les tissus du corps 7. Alors que les tissus décellularisé peuvent être utilisés directement comme substrats ou supports implantables de culture cellulaire 3D, l&#39;infiltration cellulaire peutêtre limitée dans les tissus présentant une structure dense ECM 9. De plus, l&#39;hétérogénéité naturelle dans l&#39;ECM peut entraîner une variabilité dans la fixation des cellules et la distribution dans les matrices décellularisé, ce qui pourrait avoir un impact potentiellement la réponse cellulaire 10. Dans l&#39; ensemble, tout en promettant pour certaines applications, en appliquant les tissus décellularisé dans leur forme intacte offre une polyvalence limitée en termes de propriétés d&#39;échafaudage d&#39;accord , y compris la forme, la porosité et la rigidité, ainsi que le mode de livraison pour les applications in vivo. Pour contourner ces limitations, de nombreux groupes de recherche appliquent de nouvelles méthodes de traitement pour générer des formats d&#39;échafaudage personnalisés à l&#39;aide de tissus décellularisé comme matériau de base. Dans la forme la plus simple, cela peut impliquer cryobroyage les tissus décellularisé pour générer des particules injectables ECM spécifiques des tissus 11. Ces particules ECM peuvent être incorporés en tant que cellule instructive composant dans des échafaudages composites avec d&#39; autres biomatériaux, tels que la reticulation in situ hydrogels 12, 13, 14. En plus du traitement mécanique, les tissus décellularisé peuvent également être soumis à une digestion enzymatique avec protéolytique et / ou des enzymes glycolytiques pour fabriquer des hydrogels dérivés ECM, des mousses, des microsupports et des revêtements 15, 16, 17, ainsi que pour la synthèse bioinks pour l&#39; impression 3D 18. En plus des applications de l&#39; ingénierie tissulaire, bioscaffolds dérivé ECM ont un grand potentiel pour la génération de haute fidélité dans les modèles in vitro pour la recherche biologique. Il y a un besoin important de développer des systèmes de culture cellulaire 3D qui récapitulent mieux le microenvironnement cellulaire natif 19. La plupart in vitro cétudes de culture ELL à ce jour sont réalisées sur le polystyrène de culture tissulaire (TCPS), qui a peu de corrélation avec le milieu cellulaire dynamique et biologiquement complexe trouvée dans les tissus vivants 20. Même si commode pour l&#39; étude des interactions cellulaires dans un environnement contrôlé, la mise en culture des cellules sur ces substrats rigides 2D simplifiées modifie la fixation des cellules et de la morphologie, de même que les deux cellules-cellules et cellules-ECM interactions 21, 22. Les adaptations cellulaires observées sur EPTC 2D peuvent avoir un impact des voies de signalisation intracellulaire qui régulent les fonctions cellulaires divers , y compris la survie, la prolifération, la migration et la différenciation, soulevant des questions de la pertinence des études 2D dans la modélisation des systèmes in vivo 23. Il a été plus reconnu que le comportement cellulaire peut varier considérablement dans les systèmes 2D en 3D par rapport à 24, et que biochimiques et bisignalisation omechanical avec l&#39;ECM sont des médiateurs clés de la fonction des cellules 25. De nombreux groupes ont tenté de surmonter les limites des systèmes 2D établis par revêtement EPTC avec des composants ECM tels que le collagène, la laminine et la fibronectine. Bien que ces stratégies peuvent améliorer la fixation des cellules et peuvent modifier les réponses cellulaires, ces modèles restent limitées par leur configuration 2D qui ne reproduit pas l&#39;organisation spatiale complexe ou la biochimie de l&#39;ECM natif 26, 27. Notre laboratoire de bio-ingénierie a été intéressé par le développement de bioscaffolds dérivé ECM comme substrats pour la culture cellulaire 3-D et des applications d&#39;ingénierie tissulaire. En particulier, nous avons lancé l&#39;utilisation du tissu adipeux décellularisé (DAT) comme plate - forme d&#39;échafaudage pour la régénération adipeuse 28. De plus, nous avons établi des méthodes de synthèse 3D et des micro-mousses poreuses en utilisant DAT digéré avec l&#39;enzyme pepsine protéolytique ou une enzyme glycolytique α-amylase 29, 30, 31. En particulier, nous avons démontré à travers tous ces formats d&#39;échafaudage que l&#39;ECM adipeuses fournit un microenvironnement inductif pour la différenciation adipocytaire des souches dérivées du tissu adipeux humain / cellules stromales (CSA) dans la culture. Plus récemment, nous avons étendu nos méthodes de fabrication pour produire des mousses poreuses 3D de porc α-amylase digéré décellularisé ventricule gauche (DLV) (méthodes de décellularisation adaptées de Wainwright et al. 32), et montré qu&#39;ils fournissent une plate - forme de soutien pour induire cardiomyogénique précoce l&#39; expression des marqueurs dans ASCs dérivés de matières grasses péricardiques humaines 31. Cet article décrit en détail les procédés de synthèse des mousses poreuses non chimiquement réticulés 3D et microsupports dérivés purementd&#39;α-amylase digéré ECM pour une utilisation comme 3D biologiquement complexe dans des substrats de culture cellulaire in vitro et en tant que biomatériaux pour la régénération tissulaire. En théorie, toute source d&#39;ECM contenant du collagène de poids moléculaire élevé peut être utilisé en tant que matériau de départ pour ces techniques. Pour démontrer la flexibilité de cette approche, les méthodes ont été appliquées pour générer bioscaffolds spécifiques des tissus en utilisant DAT humain, tissu cutané décellularisé porcin (DDT) 8 et DLV porcine comme des exemples représentatifs. La figure 1 donne une vue d&#39; ensemble du processus de fabrication pour les mousses dérivées ECM et microsupports. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39; ensemble de la méthode pour la production des Mousses et microsupports dérivé ECM-tissu-spécifique. 1. décellularisé tissus, préparé à la suite de décélération établieprotocoles lularization, peuvent être utilisés pour ECM dérivés spécifiques des tissus de fabrication de bioscaffold. Images macroscopiques sont présentées de DAT humaine hydraté (préparé comme décrit dans Flynn 2010 28), le DDT porcin (préparé comme décrit dans Reing, JE, et al. , 2010 8), et porcin DLV (préparé comme décrit dans Wainwright et al. 2010 32 ), à titre d&#39;exemples représentatifs de sources ECM qui peuvent être utilisés comme matières de départ. Les barres d&#39;échelle représentent 3 cm. 2. Les tissus décellularisé sont lyophilisés, puis 3. émincé mécaniquement. Les barres d&#39;échelle représentent 1 cm. 4. L&#39;ECM émincé peut alors être cryomilled, qui est facultative pour la fabrication de la mousse, mais nécessaire pour la synthèse de microporteurs. La barre d&#39;échelle représente 3 mm. 5. L&#39;ECM hachée ou cryomilled est ensuite digéré par α-amylase et on l&#39; homogénéise pour créer une suspension homogène de l&#39; ECM. La barre d&#39;échelle représente 1 cm. <strong&gt; 6a) Pour la fabrication de la mousse, la suspension de l&#39; ECM est transféré dans un moule défini par l&#39; utilisateur, congelé et lyophilisé pour générer un échafaudage poreux 3D avec une géométrie bien définie. La barre d&#39;échelle représente 1 cm. 6b) pour la fabrication microsupport, la suspension de l&#39; ECM cryomilled est électropulvérisée discrets pour générer des micro - sphériques. La barre d&#39;échelle représente 2 mm. 7. Les mousses et microporteurs peuvent ensuite être progressivement réhydratés et ensemencées avec des cellules. Des images représentatives sont montrées de ASCs humaines (cellules viables = vert) ensemencées sur une mousse DAT (à gauche) et DAT microcarrier (à droite). Les barres d&#39;échelle représentent 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ACE222.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alligator clip leads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;470149-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-amylase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101074694</td>
			<td>from Aspergillus aryzae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004251</td>
			<td>With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9879&#160;</td>
			<td>Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomilling system</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td>MM 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8624426</td>
			<td>For lyophilized ECM and bioscaffold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Hams</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6421</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-196-6</td>
			<td>Low form; volume range of 250 - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311425125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Greenfield Specialty Alcohols Inc.</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td>Absolute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>80150</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>37-501-32</td>
			<td>For transferring the foams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer ( -80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EXF40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26D</td>
			<td>To store lyophilized cryomilled ECM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held homogenizer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Speed: 8000 - 30,000 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-261-17</td>
			<td>10 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For electrospraying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750021</td>
			<td>FreeZone4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling chamber</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0213</td>
			<td>25 mL volume recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling balls</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16003-606</td>
			<td>10 mm diameter, stainless steel recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C ABD305185</td>
			<td>For dispensing ECM suspension into moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator shaker&#160;</td>
			<td>SciLogex</td>
			<td>832010089999</td>
			<td>Temperature controlled (37 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>Mandel Scientific</td>
			<td>DRU-4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470019-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21573-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309606</td>
			<td>3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 mL )</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (25 mL)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoopula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89259-968</td>
			<td>For collecting microcarriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10117-490</td>
			<td>Microprocessor controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Gamma High Voltage Research</td>
			<td>ES30P-5W/DDPM</td>
			<td>Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565321</td>
			<td>For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>22258092</td>
			<td>30 cm tubing length, 25 G 3/4 &#34; recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms

La fonction cellulaire est médiée par des interactions avec la matrice extracellulaire (ECM), qui a la composition spécifique d&#39;un tissu et une architecture complexe. L&#39;objectif de cet article est sur les procédés de fabrication de mousses poreuses dérivé ECM et microsupports pour une utilisation en tant que substrats biologiquement pertinents en 3D de pointe dans des modèles de culture cellulaire in vitro ou en tant qu&#39;échafaudages pro-régénérateurs et des systèmes de délivrance de cellule pour l&#39; ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice. Utilisation de tissus décellularisés ou collagène insoluble purifié en tant que matériau de départ, les techniques peuvent être appliquées pour synthétiser une large gamme de bioscaffolds spécifiques d&#39;un tissu avec des géométries personnalisables. Cette approche implique le traitement mécanique et la digestion enzymatique doux pour donner une suspension d&#39;ECM qui est utilisé pour fabriquer les mousses en trois dimensions ou des microporteurs au moyen de procédures de congélation et de lyophilisation contrôlées. Ces purs échafauds dérivés ECM sont très poreux, mais stable sans la nécessité d&#39;chemical agents de reticulation ou d&#39;autres additifs qui peuvent avoir un impact négatif sur la fonction cellulaire. Les propriétés d&#39;échafaudage peuvent être ajustées dans une certaine mesure par des facteurs variables tels que la concentration de la suspension de l&#39;ECM, les méthodes de traitement mécanique, ou dans des conditions de synthèse. En général, les échafauds sont robustes et faciles à manipuler, et peuvent être traités comme des tissus pour la plupart des essais biologiques standards, fournissant une plate-forme de culture cellulaire 3D polyvalent et convivial qui imite la composition ECM native. Dans l&#39; ensemble, ces méthodes simples pour la fabrication de mousses et microporteurs dérivés ECM sur mesure peuvent être d&#39;intérêt pour les biologistes et ingénieurs biomédicaux comme des plates - formes cellulaires instructives spécifiques des tissus pour in vitro et in vivo applications.

Dans l&#39;étude actuelle, nous avons fabriqué des mousses dérivées ECM et microporteurs utilisant DAT humain, le DDT porcine et DLV porcine comme des exemples représentatifs démontrant que les techniques peuvent être appliquées pour générer bioscaffolds spécifiques aux tissus en utilisant une variété de tissus décellularisé comme sources d&#39;ECM ( Figure 1). Dans les deux cas la mousse et la fabrication microsupport, la technique Nishihara de solubilisation de collagène avec l&#39;enzyme glycolytique α-amylase 37 est adapté pour générer un visqueux suspension ECM à partir des matières de départ de tissu décellularisé, qui est utilisé pour synthétiser les bioscaffolds par des procédures de congélation et de lyophilisation contrôlées. Pour fabriquer les mousses, les tissus décellularisés peuvent être traités soit par hachage mécanique ou cryobroyage à augmenter la zone de surface avant la digestion enzymatique. Suivant45; amylase traitement et l&#39;homogénéisation, la suspension résultante ECM est distribué dans un moule défini par l&#39;utilisateur, qui est ensuite congelée et lyophilisée. Les échafaudages peuvent être stockés de manière stable dans un état sec pendant une période de temps prolongée. Avant l&#39;utilisation dans des études de culture cellulaire, les échafauds lyophilisées doivent être soumis à un processus de réhydratation contrôlée qui produit poreux et mousses homogènes hautement hydratés dérivés d&#39;ECM pur (Figure 3A). Si les mousses sont réhydratés trop rapidement, un gonflement rapide peut endommager les caractéristiques structurelles délicates, ce qui entraîne une perte d&#39;intégrité et de l&#39;effondrement structurel. En général, les mousses conservent la forme définie par la réhydratation suivante du moule original et sont stables sans nécessiter de réticulation chimique. Figure 3B montre des images au microscope électronique à balayage (SEM) représentatif de la DAT, DDT, et DLV mousses fabriquées avec ECM cryomilled à une concentration de 35 mg / ml et une température de congélation de -80 &amp; #176; C. <img alt="figure 3" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" /> Figure 3. représentatifs d&#39; images de la DAT, DDT, et DLV Mousses fabriqué avec Cryomilled ECM Suspensions à une concentration de 35 mg / mL et congelé à -80 ° C. A: vue macroscopique de la DAT, DDT, et DLV broyé mousses synthétisés dans un moule à plaques de culture tissulaire à 48 puits suivant la réhydratation. Les barres d&#39;échelle représentent 1 cm. B: les images au MEB des mousses DAT, DDT, et DLV montrant une ultrastructure poreuse homogène. Les barres d&#39;échelle représentent 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> Les suspensions cryomilled ECM peuvent également être utilisés pour générer des microsupports purs dérivé ECM via des techniques de électronébulisation (Figure 2 </strong&gt;). Pour chaque source d&#39;ECM, la concentration de la suspension, une jauge à aiguille, la vitesse de perfusion, et la tension peut être réglée pour générer des micro - sphériques discrètes allant de 350 à 500 um de diamètre suivant la réhydratation contrôlée (Figure 4A). Alors que les microporteurs peuvent être stockées dans un état lyophilisé, il est recommandé pour faciliter la manipulation qu&#39;ils sont dispensés ou tamisés à une plage de taille souhaitée suivant la remise en suspension dans l&#39;éthanol. Imagerie SEM suggère que l&#39;ultrastructure de microsupport peut varier en fonction de la source de tissu décellularisé (figure 4B). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" /> Figure 4. Images représentatives du DAT, le DDT et DLV microsupports avec Cryomilled ECM Fabricated à une concentration Suspensions de 35 mg / ml, un taux de perfusion de 0,5 ml / min, et une tension appliquée de 20 kV. A: vue o macroscopiquesf les DAT hydratés, le DDT et les microsupports DLV. Les barres d&#39;échelle représentent 4 mm. B: les images SEM des DAT microporteurs, le DDT et DLV montrant que la ultrastructure et la taille peut varier en fonction de la source d&#39;ECM. Les barres d&#39;échelle représentent 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> Les propriétés mécaniques de l&#39;échafaudage sont tributaires de la source d&#39;ECM, le procédé de traitement appliqué ( par exemple par rapport à mâcher cryobroyage), la concentration de la suspension de l&#39; ECM, et la température de congélation. En règle générale, les échafaudages sont doux et souple, avec des modules d&#39;Young dans la gamme de 1 à 5 kPa signalé pour la DAT (50 et 100 mg / ml) 29 et de mousses DLV (20-50 mg / mL) 31 et &lt;1 kPa pour les microporteurs. Les mousses cryomilled sont généralement plus doux eune des mousses émincé en raison de leur nature plus perturbé. systèmes d&#39;essais mécaniques spécialisés équipés de cellules de charge hautement sensibles sont nécessaires pour la caractérisation précise des propriétés de compression. En règle générale, les mousses et les microporteurs inférieurs auraient que les tissus moduli décellularisé natifs en raison des étapes de traitement supplémentaires impliquées dans la fabrication, y compris la digestion enzymatique et l&#39;homogénéisation, ainsi que le caractère non réticulé de façon covalente des échafauds. Toutefois, cela peut varier en fonction du tissu d&#39;intérêt. Par exemple, dans des travaux antérieurs, nous avons constaté que les mousses fabriquées à DAT émincé de fortes concentrations d&#39;ECM (100 mg / ml) a semblable à moduli tissu adipeux natif 29. Les mousses dérivées ECM-réhydratées et microsupports peuvent être ensemencés avec des cellules dans des conditions de culture statique ou dynamique pour fournir une plate - forme de support de cellules pour des études in vitro de culture de cellules et / or délivrance in vivo de la cellule. Bien que les échafaudages sont généralement favorables à la fixation des cellules, l&#39;efficacité d&#39;ensemencement dépendra de la source d&#39;ECM, la géométrie de l&#39;échafaudage et de la porosité, et le type cellulaire d&#39;intérêt. A ce titre, les méthodes d&#39;ensemencement et les densités nécessiteront une optimisation en fonction des conditions définies par l&#39;utilisateur. Pour les mousses décrites ci - dessus, nous recommandons une concentration cellulaire de départ dans la plage de 0,25 - 1 x 10 6 cellules / échafaudage, avec ensemencement dynamique sur un agitateur orbital pour améliorer l&#39; infiltration de cellules. Pour les microporteurs, nous vous proposons une densité de semis initiale de l&#39;ordre de 25.000 - 50.000 cellules / mg de microporteurs, avec l&#39; ensemencement effectué dans des conditions dynamiques dans un flacon de culture centrifuge 11. Les images présentées au bas de la figure 1 représentent les ASC de l&#39; homme ensemencées sur une mousse de DAT ( à gauche) ou DAT microsupport ( à droite, préalablement marqué avec un colorant réactif amine et apparaissant bleu 13), tel que visualisé par micro confocalscopie utilisant un colorant de viabilité cellulaire fluorescent (cellules vivantes = vert, les cellules mortes = rouge; barres échelle représentent 100 um). La microscopie confocale peut être utilisé pour visualiser les cellules ensemencées sur la surface des mousses jusqu&#39;à 2 mm d&#39;épaisseur, mais la visualisation dans les régions centrales des échafauds est limitée par leur nature opaque. Cependant, les mousses et microporteurs peuvent être traités comme des tissus et paraffine ou cryo-sectionnée pour les analyses histologiques et immunohistochimique pour visualiser la distribution cellulaire et l&#39;expression des marqueurs.

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Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

La matrice extracellulaire tissu-spécifique (ECM) est un médiateur clé de la fonction cellulaire. Cet article décrit les méthodes de synthèse pures mousses dérivées ECM et microporteurs qui sont stables dans la culture sans la nécessité d&#39; une réticulation chimique pour des applications en 3D avancées in vitro des modèles de culture cellulaire ou bioscaffolds pro-régénération.

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