Name: fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms at JoVE.com

The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.

החוקרים אין לחשוף.

באופן כללי, bioscaffolds נגזר רקמות decellularized יכול יותר מקרוב בקירוב את רכב 3D מורכב במבנה של ECM ב במייקרו-הסביבה הסלולרית מהקורה לעומת פיגומים סינטטיים או מודלי תרבות סטנדרטיים מבוססים על 2D TCPS. כפי שנאמר קודם לכן, אינטראקציות תא-ECM חשובים באופן קריטי בתיווך התנהגות הסלולר הן בתרבות בגוף 1. מתוך הכרה כי התכונות הביוכימיות, ביופיסיקליים, ו ביומכנית של ECM הן ייחודיות לכל רקמה, יש להגדיל ראיות לתמוך את הרציונל ליישום גישות ספציפיות-רקמות בעיצוב של חומרים ביולוגיים עבור הנדסת רקמות, כמו גם בפיתוח של יותר מבחינת פיזיולוגית מודלי תרבות רלוונטית עבור ניסויים במבחנה ב 20. ניצול רקמות decellularized כחומר החל, שיטות שלנו יכול לשלב את יצירתו המורכבת של ECM רקמות ספציפיות בתוך קאסט יותרפורמטי פיגום omizable. בעוד צעדי עיבוד מכני האנזימטית יגרמו להפסד של ultrastructure ECM הילידים, מחקרים קודמים עם DAT הוכיחו כי ההשפעות המאלפות של ECM נגזרות השומן שמורות בפורמטי פיגום אלה, דבר המצביע על כך בהרכב bioscaffold הוא מתווך מפתח של תא פונקציה 11, 29. יתרון משמעותי באמצעות קצף נגזרות ECM ו- microcarriers כמו מצעי תרבית תאים לעומת רקמות decellularized השלמות הוא שהם יותר הומוגנית, אשר יכולים לשפר את האחידות בחלוקת תא תאי תאים / אינטראקציות תא-ECM. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מנוצלות כדי ליצור מגוון רחב של bioscaffolds רקמות ספציפיות לשימוש בתרבית תאים ויישומים-הנדסת רקמות. לדוגמה, בנוסף DAT, DDT, ו DLV, במעבדה שלנו בהצלחה יישמה טכניקות אלה ליצירת 3D porקצף יחידות ארגוני באמצעות עצם decellularized, סחוס, גרעין pulposus, סיסטיק כטבעת, כמו גם זמין מסחרי, קולגן המסיס נגזר גיד שור. מנקודת מבט במבחנה, bioscaffolds אלה יכולים לשמש כבסיס מודלי תרבות 3D גבוהים ונאמנים עבור חוקרת פתולוגיה ביולוגיה, פיזיולוגיה או מחלה הסלולר 38, כמו מצעים ביו פלטפורמות הקרנת תרופת תפוקה גבוהה 39, או מטריצות מלמדות על גזע תא בידול 40, 41. קצף DAT, DDT ו- DLV מפוברק בריכוזים של 25 - 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל יציבים לטווח ארוך בתרבות במבחנה (נבדק עד 28 ימים). יתר על כן, כל שלושת סוגי microcarriers יכולים לתמוך מצורף תא התפשטות בתנאים דינאמיים במערכת תרבות הטווה נמוכה גזירה (10 - 15 סל&quot;ד) עבור 2 שבועות לפחות. עבור יישומים בחי הביולוגי biodegradaקצפי microcarriers ECM נגזרת ble הבטחה כמו-המדף מחוץ מוצרים לעורר שיפוץ רקמות ובונה והתחדשות 11, 29. יתר על כן, פיגומים-דבק התא יכולים לשמש כמערכות משלוח טיפול בתא 42, 43. כדוגמה, קצף DAT הוצגו לקדם אנגיוגנזה adipogenesis כאשר זורעים עם ASCs אלוגנאית ו מושתל מתחת לעור במודל חולדה עם מערכת חיסון תקינה 29. ביחס DAT פגע, DAT מעובד יותר גבוה הקצף מושפל הרבה יותר מהר, עם ירידה של 50% בנפח ציין ב 3 שבועות כפי שהם הפכו משולבים עם הרקמות המארחות, וכמעט מוחלט ספיגה ידי 12 שבועות. עם זאת, הקצף גם מושרה תגובת אנגיוגנזה חזקה יותר, מה שמרמז כי ECM-מתעכל האנזים היה פרו-רגנרטיבית תופעות ייחודיות. באופן דומה, microcarriers הנגזרות ECM יכול לשמש במבחנה &lt;/ em&gt; מצעי תרבית תאים בתוך מערכות התרבות דינמיות וכלי רכב מסירת תא בזריקות כמו 11, 30, 44. באופן ספציפי יותר, משטח גדול בקוטר קטן באזור של microcarriers יכול לאפשר משלוח של כמות גדולה של תאים בנפח קטן, תוך מתן מטריצה שעשויים לעזור לתמוך כדאיות התא ולהגדיל החזקת התא באתר של הזרקת 30. לפני שימוש בכל מערכת חיים, הוא קריטי כדי להבטיח כי ECM המקור נטול משמעותי של מרכיבים תאיים אנטיגני ו / או חומרים כימיים decellularization ציטוטוקסיות שעלולים לעורר תגובת מארח שלילית 7. פפסין אנזים פרוטאוליטי נפוץ בהכנת הידרוג&#39;ל נגזרת ECM 15. פפסין הוא פרוטאז הלא ספציפית כי תהיה לעכל חלבוני קולגן אחר ECM into שברים קטנים 45. בעוד הידרוג&#39;ל המפוברק מ ECM-מתעכל פפסין דווח השפעות תא-מאלף, מגבלה היא כי חומרים אלה נוטים להיות מאוד מכאניים חלשים 46. בשנת הפיתוח הראשוני שלנו של microcarriers DAT, השתמשנו בגישה מורכבת שבו-פפסין מתעכל DAT שולב עם אלגינט והוסיף dropwise לתוך CaCl 2 כדי ליצור חרוזים כדוריים 30. החרוזים היו ובהמשך צילום צולב ואת אלגינט הופק באמצעות נתרן ציטרט. בנוסף הדרישה crosslinking כימיים, למגבלה העיקרית הייתה כי microcarriers מפוברק עם גישה זו הייתה יציבות עניים מתחת מגוון גודל של 900 - 950 מיקרומטר 30. במקום פפסין, השיטות שהוצגו כאן לנצל עיכול מתון יותר של ECM עם האנזים glycolytic α-עמילאז, אשר הניחו להדבק לקבוצות פחמימות מן telopeאזורים ptide של קולגן, הגברת מסיסות ובכך חומצה אצטית 37. גישה זו מאפשרת בידוד של קולגן פולימר מאוד שיכול לשמש ליצירת קצף microcarriers ECM הנגזרות טהור ללא צורך crosslinking כימיים או תוספים אחרים. bioscaffolds אלה התייצב באמצעות אינטראקציות פיזיות מליטה מימן בין הסיבים קולגן השתמרו היטב, בדומה הקולגן במיקרו-סביבה של ECM הילידים. הקצף הוא פלטפורמה גמישה ביותר שיכול להיות מפוברקת במגוון רחב של גיאומטריות תלוי העובש הספציפי שנבחר. עבור מחקרי תרבית תאים, הקצף ניתן להטיל ישירות צלח היטב TCPS, ליצירת ציפויים או פיגומי 3D של משתנה עובי. לפברק קצף 3D עם משטחים מאוד אחידים, מומלץ כי עובש מנהג נועד שניתן חתום על שני הצדדים עם מגלשות פלסטיק או זכוכית. כך או ECM טחון או cryomilled יכול לשמש כדי לסנתזהקצף. באופן כללי, מצאנו כי קצף cryomilled נוטה להיות רך macroscopically ויש לי ultrastructure שבש יותר בריכוזים נמוכים 31, 36. בהתאם למקור הרקמה, מדרגות העיבוד המכאניות הנוספות עלולות לגרום שינויים בהרכב ECM שיכול להשפיע על תפקוד תא. לדוגמה, בעבודה הקודמת שלנו, laminin זוהה קצף DLV טחון, אבל לא cryomilled DLV קצף 31. לעומת זאת, הייתי קולגן, קולגן IV, laminin, ו פיברונקטין התגלו בשני טחון cryomilled DAT קצף 36. בנוסף מדרגות העיבוד המכאניות, הגודל הנקבובי הנקבובי של הקצף יכול להיות מכוון במידה מסוימת על ידי שינוי ריכוז השעית ECM ואת טמפרטורת קיפאון 47. באופן כללי, קצף ריכוז נמוך (~ 10 - 15 מ&quot;ג / מיליליטר) הם איכותיים יותר נקבוביים, אך עלולים להתכווץ במהירות ויש ענייםיציבות בתרבות לטווח ארוך 31, 36. באופן דומה, שיעור הקפאה איטי, בדרך כלל מושגת על ידי טמפרטורת קיפאון גבוהה, יכול לגרום נקבוביות גדולות יותר של הקצף בגלל הגודל של גבישי הקרח נוצרו במהלך הייצור 29. כל הפרמטרים הללו עשויים להשפיע אינטראקציות תא עם החומרים, לרבות עיקול, הסתננות, לבין שיפוץ. לדוגמא, צמיחת תאים על קצף כי הם בדויים עם ריכוזי ECM גבוהים עשויה להיות מוגבלת לאזורי המשטח, במיוחד עם מקורות ECM טחונים בתנאי תרבות סטטית 36. עבור microcarriers, הפרמטרים המרכזיים שיכול להיות מכוון הם ריכוז השעית ECM, מחט מד, ו מתח מיושם, עם ריכוזים גבוהים יותר בדרך כלל מניבי microcarriers כי הם יותר יציבים תחת תרבות הדינמית ארוך טווח. בעקבות חניכה של electrospraying, את suspens ECMטיפות יון צריך ליפול במהירות למרכז של הבקבוק, לקראת לכיוון אספן רדיד אלומיניום. כדי למנוע צבירה, חשוב כי חרוזי קשר עם החנקן הנוזלי לפני בנייר. המרחק בין המחט ואת השטח של החנקן הנוזלי יכול להיות מותאם כדי לענות על הדרישות הללו. חשוב לציין כי אופטימיזציה ייתכן שתידרש בהתאם את המאפיינים של כל מקור ECM ספציפי, בפרט בבחירת טווח הריכוז כי יפיק bioscaffolds היציב. גורם מרכזי נוסף הוא פרוטוקול decellularization המשמש להפקת חומרי המוצא, כמו שיטות decellularization כי לבזות את ECM או נוכחות של חומרים כימיים שיורית (למשל, פעילי שטח) עלול להשפיע על יציבות שלילית של קצפים microcarriers כתוצאה. אם אתגרים הם נתקלו עם יציבות bioscaffold, אפשרויות שניתן לחקור כולל שימוש בתהליך התייבשות הדרגתי יותר, הגדלת תליוני ECMריכוז ension, ולחקור טחון לעומת ECM cryomilled. האם כל אחת מהאפשרויות הללו לא מצליחים לפתור את הבעיה, ייתכן שיהיה צורך לחקור פרוטוקולים decellularization אלטרנטיבית או מקורות ECM. כדי להבטיח שחזור במהלך ייצור גרדום, טיפול מיוחד יש לנקוט בכל צעדים מסוימים בפרוטוקול. כאשר cryomilling הרקמות decellularized, מומלץ כי טחינה להתנהל מיד לאחר lyophilization בסביבה יבשה כדי להפחית את הסיכוי של אגרגציה בשל ספיגת לחות מהסביבה. במהלך ייצור microcarrier, הוא הציע כי ההשעיה היא electrosprayed בקבוצות קטנות, עם נפח מקסימאלי של 3 מיליליטר, כדי למנוע בעיות עם קירור מדגם שיכול לגרום לסתימה של המחט. יתר על כן, זה הכרחי כי microcarriers אינם רשאים להפשיר לאחר תהליך electrospraying. כדי לשמור על הגיאומטריה הכדורית שלהם ויציבות מכנית, microcarriERS יש לאסוף מן חנקן נוזלי, מועבר במיכל חנקן נוזלי מלא, ומיד lyophilized. לבסוף, הן עבור הקצפים microcarriers, זה קריטי, כי צעדי ההתייבשות מבוצעים לאט על פני תקופה של מספר ימים. התייבשות מהירה עלולה לגרום לקריסה מבנית על המקרו ו / או בקנה מידת מייקרו. בהמשך, התייבשות חייב להתרחש באיטיות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר קטנות בתוך הפיגום, אשר יכול לדרוש כמות משמעותית של זמן דגה תחת ואקום אור. לסיכום, השיטות שהוצגו במאמר זה יכול לשמש כדי לפברק מגוון רחב של קצף רקמות ספציפיות ו microcarriers המורכבת ECM הטהור, הלא-כימי צולבים. יתרון לחוקרים ביולוגיים הוא כי bioscaffolds קל לטפל וניתן מעובד בדומה רקמות בעת ביצוע ניתוחים עם טכניקות כגון היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, או גן מבחני חלבון ביטוי.בנוסף, הפיגומים נגזרים ECM יכולים להיות מושפלים enzymatically לחלץ אוכלוסיות תאי זרע או יכולים לשמש ישירות כרכב משלוח התא מתכלה ביולוגי. בסך הכל, פלטפורמה טכנולוגית גמישה זו מחזיק כלי נהדר עבור יישומים רבים, כוללים ללימודי תרבות תאי 3D חוקרים את תפקוד תא, כמו מצעי הרחבת תא, וכתוצאת bioscaffolds פרו-רגנרטיבית.

מטריקס (ECM) מורכב רשת 3D מורכבת של חלבונים, גליקופרוטאינים, ורב-סוכרים 1. שבעבר נחשב מסגרת מבנית בעיקר, זה עכשיו הוא מוכר היטב כי ECM משלבת מגוון רחב של מולקולות ביו עם תפקידים פונקציונליים חשובים 2. אינטראקציות תא-ECM יכול לכוון תא הישרדות, הדבקה, הגירה, שגשוג, והבחנה 3. בעוד המעמדות העיקריות של מקרומולקולות ECM הן בדרך כלל גם נשמרות לאורך רקמות ומינים, בכל רקמה יש רכב מטריקס ייחודי ואדריכלות 4. בסך הכל, ECM רקמות ספציפיות מספקת microenvironment מאלפת שמתווך פונקציה מן התת-תאי סולם רקמות / איברים 5. בשל התפקיד המכריע של ECM בתיווך פונקציה הסלולר, יש כבר עניין גובר דהvelopment של bioscaffolds הנגזרות ECM עבור יישומים בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. בפרט, השיטה של decellularization נחקרה בהרחבה כאמצעי להשגת ECM מתוך מגוון רחב של רקמות לשימוש כחומר פיגומים לשחזור רקמות תאי משלוח 5, 6, 7. Decellularization בדרך כלל כולל סדרה של מכני, כימי, ו / או בשלבי טיפול ביולוגי ממוקד בהסרת תאים מרכיבים תאיים, תוך אידיאלי גרימת שינויים מינימליים למבנה 3D והרכב של ECM 8. באמצעות מדידות בספרות, פרוטוקולי decellularization שונים ניתן לזהות כמעט לכל רקמה בגוף 7. בעוד רקמות decellularized ניתן להשתמש ישירות כמו פיגומים מושתלים או מצעי תרבית תאי 3D, חדירת הסלולר רשאיתיוגבל ברקמות עם מבנה ECM צפוף 9. בהמשך, ההטרוגניות הטבעי ECM עלול לגרום השתנות מצורפות תא והפצה בתוך מטריצות decellularized, אשר עלול להשפיע על התגובה התאית 10. בסך הכל, תוך שהם מבטיחים עבור יישומים מסוימים, החלים רקמות decellularized בצורתם השלמה מציע צדדי מוגבל מבחינת מאפייני פיגום הכוונון כולל צורה, נקבובי, וקשיחות, כמו גם את המצב המסירה עבור יישומי in vivo. כדי לעקוף מגבלות אלו, קבוצות מחקר רבות מיישמות שיטות עיבוד נוספות ליצירת פורמטי פיגום אישית באמצעות רקמות decellularized כחומר בסיס. בצורה הפשוטה ביותר, זו עשויה להיות כרוכה cryomilling רקמות decellularized לייצר חלקיקי ECM רקמות ספציפיות להזרקת 11. חלקיקי ECM אלה עשויים להיות משולבים כמו-ומכשירים סלולרייםרכיב ctive פיגומים מרוכבים עם חומרים ביולוגיים אחרים, כגון באתרו crosslinking הידרוג&#39;ל 12, 13, 14. בנוסף עיבוד מכני, רקמות decellularized יכול גם להיות נתון עיכול אנזימטי עם פרוטאוליטים ו / או אנזימים glycolytic לפברק הידרוג&#39;ל הנגזרות ECM, קצף, microcarriers, וציפויים 15, 16, 17, כמו גם לסנתז bioinks להדפסה 3D 18. בנוסף ליישומים הנדסיים-רקמה, bioscaffolds נגזרת ECM להחזיק פוטנציאל גדול עבור הדור של נאמנות גבוהה בדגמים במבחנה למחקר ביולוגי. קיים צורך משמעותי לפתח מערכות תרבית תאי 3D כי טוב לשחזר את המיקרו-סביבת הסלולר יליד 19. רוב במבחנה גell מחקרים בתרבות עד כה נערכים בימי פוליסטירן בתרבית רקמה (TCPS), אשר יש קורלציה קטנה עם המילייה הסלולר המורכב ודינמי ביולוגיים נמצא בתוך רקמות חיות 20. בעוד נוח לומד אינטראקציות הסלולר בתוך סביבה מבוקרת, culturing תא על מצעי 2D הנוקשים אלה פשוטות משנה מצורף תא ומורפולוגיה, כמו גם שני תאי תאים ותא-ECM קשרי גומלין 21, 22. העיבודים הסלולר שנצפה על TCPS 2D יכול להשפיע מסלולי איתות תאיים המווסתים פונקציות תאים שונים כולל הישרדות, התפשטות, הגירה, והבחנה, מעלה שאלות לגבי מידת הרלוונטיות של מחקרים 2D ב דוגמנות במערכות vivo 23. יש כבר הכרה גוברת כי התנהגות הסלולר יכול להשתנות במידה רבה 2D לעומת מערכות 3D 24, וכי ביוכימיים דואיתות omechanical עם ECM הם מתווכים עיקריים של תא פונקציה 25. קבוצות רבות ניסו להתגבר על המגבלות של מערכות 2D הוקמה על ידי ציפוי TCPS עם רכיבים ECM כגון קולגן, laminin, ו פיברונקטין. בעוד אסטרטגיות אלו יכולות לשפר מצורפות תא עשוי לשנות את תגובות הסלולר, מודלים אלה נשארים מוגבלים על ידי תצורת 2D שלהם כי לא לחקות את הארגון המרחבי המורכב או הביוכימיה של ECM ילידי 26, 27. המעבדה לביו-הנדסה שלנו כבר מתעניינים בפיתוח של bioscaffolds הנגזרות ECM כמו מצעים עבור יישומים תרבית תאים 3-D ורקמות-הנדסה. בפרט, יש לנו חלוץ השימוש ברקמה שומנית decellularized (DAT) כפלטפורמת פיגומים להתחדשות שומנית 28. יתר על כן, הקמנו שיטות סינתזה microcarriers 3D קצף נקבובי באמצעות DAT מתעכל עם פפסין אנזים פרוטאוליטי או אנזים glycolytic α-עמילאז 29, 30, 31. יש לציין, שהראנו בכל פורמטי פיגום אלה כי ECM הנגזרות השומן מספק במיקרו-סביבה אינדוקטיביים עבור בידול adipogenic של תאי גזע / סטרומה הנגזרות השומן האנושי (ASCs) בתרבות. לאחרונה, הרחבנו שיטות הייצור שלנו כדי ליצור קצף נקבובי 3D מ חזירי-מתעכל-עמילאז α decellularized החדר השמאלי (DLV) (שיטות decellularization מותאמת ויינרייט et al. 32), והראה כי הם מספקים פלטפורמה תומכת גרימת cardiomyogenic מוקדם ביטוי סמן ב ASCs נגזר שומן אנושי קרום הלב 31. מאמר זה מתאר בפירוט את שיטות סינתזה כימית הלא קצפי microcarriers נקבוביים 3D צולבים נבעו משיקוליםמ ECM-עמילאז מתעכל α לשימוש 3D המורכב ביולוגי מצעי תרבית תאים במבחנה וכפי biomaterials לשחזור רקמות. בתיאוריה, כל מקור ECM המכיל קולגן משקל מולקולרי גבוה עשוי לשמש כחומר מוצא את הטכניקות הללו. כדי להדגים את הגמישות של גישה זו, השיטות יושמו ליצור bioscaffolds רקמות ספציפיות באמצעות אדם DAT, רקמות עורי decellularized חזירי (DDT) 8, ו חזירי DLV כדוגמאות נציג. איור 1 מספק סקירה ויזואלית של תהליך הייצור עבור קצף נגזרות ECM ו- microcarriers. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig1.jpg" /> איור 1. סקירה כללית של השיטה לייצור של קצף הרקמות ספציפי נגזרות ECM ו- Microcarriers. 1. רקמות decellularized, הוכנו לאחר שהוקמה decelפרוטוקולים lularization, ניתן להשתמש עבור ייצור bioscaffold רקמות ספציפיות הנגזרות ECM. תמונות מאקרוסקופיים מוצגים של DAT האדם hydrated (מוכן כמתואר פלין 2010 28), DDT חזירי (מוכן כמתואר Reing, JE, et al. 2010 8), ו DLV חזירי (מוכן כמתואר ויינרייט et al. 2010 32 ניתן להשתמש), כדוגמאות של מקורות ECM כי נציג כחומרי מוצא. ברי סולם מייצגים 3 סנטימטר. 2. רקמות decellularized הם lyophilized, ולאחר מכן 3. טחון מכנית. ברי סולם מייצגי 1 סנטימטר. 4. ECM טחון לאחר מכן ניתן cryomilled, אשר הוא אופציונלי עבור ייצור קצף, אך נדרש עבור סינתזה microcarrier. בר סולם מייצג 3 מ&quot;מ. 5. ECM הטחון או cryomilled אז מתעכל עם α-עמילאז הומוגני ליצור השעית ECM הומוגנית. בר סולם מייצג 1 ס&quot;מ. <strאונג&gt; 6 א) עבור ייצור קצף, השעית ECM מועבר לתוך lyophilized המוגדר על ידי המשתמש עובש, קפוא, וכדי ליצור פיגום 3D נקבובי עם גיאומטריה מוגדרת היטב. בר סולם מייצג 1 ס&quot;מ. 6b) עבור ייצור microcarrier, השעית ECM cryomilled היא electrosprayed ליצור microcarriers הכדורי דיסקרטי. בר סולם מייצג 2 מ&quot;מ. 7. קצפי microcarriers לאחר מכן ניתן rehydrated בהדרגה זורע עם תאים. תמונות מייצגות מוצגות של ASCs האנושי (תאי קיימא = ירוק) זורעות על קצף DAT (משמאל) microcarrier DAT (מימין). ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ACE222.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alligator clip leads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;470149-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-amylase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101074694</td>
			<td>from Aspergillus aryzae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004251</td>
			<td>With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9879&#160;</td>
			<td>Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomilling system</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td>MM 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8624426</td>
			<td>For lyophilized ECM and bioscaffold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Hams</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6421</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-196-6</td>
			<td>Low form; volume range of 250 - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311425125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Greenfield Specialty Alcohols Inc.</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td>Absolute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>80150</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>37-501-32</td>
			<td>For transferring the foams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer ( -80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EXF40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26D</td>
			<td>To store lyophilized cryomilled ECM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held homogenizer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Speed: 8000 - 30,000 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-261-17</td>
			<td>10 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For electrospraying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750021</td>
			<td>FreeZone4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling chamber</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0213</td>
			<td>25 mL volume recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling balls</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16003-606</td>
			<td>10 mm diameter, stainless steel recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C ABD305185</td>
			<td>For dispensing ECM suspension into moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator shaker&#160;</td>
			<td>SciLogex</td>
			<td>832010089999</td>
			<td>Temperature controlled (37 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>Mandel Scientific</td>
			<td>DRU-4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470019-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21573-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309606</td>
			<td>3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 mL )</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (25 mL)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoopula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89259-968</td>
			<td>For collecting microcarriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10117-490</td>
			<td>Microprocessor controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Gamma High Voltage Research</td>
			<td>ES30P-5W/DDPM</td>
			<td>Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565321</td>
			<td>For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>22258092</td>
			<td>30 cm tubing length, 25 G 3/4 &#34; recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms

תפקוד תא מתווך על ידי אינטראקציות עם תאי מטריקס (ECM), אשר יש רכב ואדריכלות רקמות ספציפיות מורכבים. ההתמקדות של מאמר זה היא על השיטות בודות קצף נקבובי הנגזרות ECM ו- microcarriers לשימוש כמו מצעים ביולוגיים-רלוונטיים 3D המתקדם במודלי תרבית תאים במבחנה או כמו פיגומים פרו-רגנרטיבית ומערכות אספקת התא עבור הנדסת רקמות ורפואת רגנרטיבית. שימוש ברקמות decellularized או קולגן מסיס מטוהרים כחומר מוצא, הטכניקות ניתן ליישם לסנתז מגוון רחב של bioscaffolds רקמות ספציפיות בגיאומטריות להתאמה אישית. הגישה כרוכה עיבוד מכני ועיכול אנזימטי מתון להניב ההשעיה ECM המשמש לפברק קצף תלת ממדי או microcarriers באמצעות הליכי הקפאה lyophilization נשלט. פיגומי ECM נגזרות טהורים אלה הם מאוד נקבוביים, עדיין יציבים ללא הצורך chemicאל crosslinking סוכנים או תוספים אחרים שעשויים להשפיע לרעה על תפקוד התא. מאפייני הפיגום יכולים להיות מכוונים במידה מסוימת על ידי גורמים שונים כגון ריכוז השעית ECM, שיטות עיבוד מכאניות, או תנאי סינתזה. באופן כללי, את הפיגומים הם חזקים וקלים לטפל, והוא יכול להיות מעובד כמו רקמות עבור רוב הבדיקות ביולוגיות סטנדרטיות, מתן פלטפורמת תרבית תאי 3D תכליתית וידידותי למשתמש המחקה את הרכב ECM ילידים. בסך הכל, שיטות פשוטות אלה עבור בודת קצף אישית נגזרות ECM ו- microcarriers עשויות להיות עניין שניהם הביולוגים והמהנדסים ביו כפלטפורמות רקמות ספציפיות תא-מאלף עבור במבחנה ביישומי vivo.

במחקר הנוכחי, יש לנו מפוברק קצף ECM הנגזרות microcarriers באמצעות DAT האנושי, DDT חזירי, ו חזירי DLV כדוגמאות נציג הוכחת כי טכניקות ניתן ליישם על מנת ליצור bioscaffolds רקמות ספציפיות תוך שימוש במגוון של רקמות decellularized כמקורות ECM ( איור 1). עבור שניהם ייצור קצף microcarrier, הטכניקה Nishihara של solubilization קולגן עם האנזים glycolytic α-עמילאז 37 הותאם כדי ליצור ההשעיה ECM צמיגה מהחומרים decellularized החל רקמות, אשר משמש כדי לסנתז את bioscaffolds באמצעות הליכי הקפאה lyophilization נשלט. לפברק קצף, רקמות decellularized יכול להיות מעובד או באמצעות מִצטַעֲצֵעַ מכני או cryomilling כדי להגדיל את שטח הפנים לפני עיכול אנזימטי. הבא45; -amylase טיפול ויצירת הומוגניות, השעית ECM כתוצאה הוא חלקה לתוך תבנית מוגדרת משתמש, אשר אז קפוא ו lyophilized. הפיגומים ניתן לאחסן ביציבות במצב יבש במשך תקופה ארוכה של זמן. לפני השימוש במחקרי תרבית תאים, פיגומי lyophilized חייבים להיות נתונים תהליך התייבשות מבוקר כי תשואות נקבובי מאוד-hydrated קצף הומוגנית נגזר ECM הטהור (איור 3A). אם קצף הם rehydrated מהר מדי, נפיחות מהירה עלולה לגרום נזק תכונות מבניות עדין, וכתוצאה מכך אובדן של יושר התמוטטות מבנית. באופן כללי, הקצף יישמר על הצורה שהוגדרה על ידי ההתייבשות הבאה העובש המקורי יציבים ללא צורך crosslinking כימי. איור 3B מציג מיקרוסקופ אלקטרונים סורק נציג תמונות (SEM) של DAT, DDT, ו DLV קצף מפוברק עם ECM cryomilled בריכוז של 35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו טמפרטורת הקיפאון של -80 &amp; #176; ג. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" /> איור 3. תמונות נציג של DAT, DDT, ו DLV קצף מפוברק עם Cryomilled ECM השעיות בריכוז של 35 מ&quot;ג / מ&quot;ל ו קפוא ב -80 מעלות צלזיוס. ת: נוף מאקרוסקופית של DAT, DDT, ו DLV הסתובבו קצף מסונתז עובש צלחת בתרבית רקמה 48-היטב הבאים התייבשות. ברי סולם מייצגי 1 סנטימטר. B: תמונות SEM של DAT, DDT, קצף DLV מראה ultrastructure נקבובי הומוגנית. ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> מתלי ECM cryomilled יכולים לשמש גם כדי ליצור microcarriers ECM נגזרות טהור באמצעות טכניקות electrospraying (איור 2 </strאונג&gt;). עבור כל מקור ECM, ריכוז ההשעיה, מחט מד, קצב עירוי, ואת המתח יכול להיות מכוון לייצר microcarriers כדורית דיסקרטית החל 350 - 500 מיקרומטר בקוטר הבאים התייבשות מבוקרת (איור 4A). בעוד microcarriers ניתן לאחסן במצב lyophilized, מומלץ על מנת להקל על טיפול שהם ויתרו או מסתננים למגוון לגודל רצוי הבא resuspension באתנול. הדמיה SEM מרמזת כי ultrastructure microcarrier יכול להשתנות בהתאם למקור הרקמה decellularized (איור 4 ב). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" /> איור 4. תמונות נציג של DAT, DDT, ו DLV Microcarriers מפוברק עם Cryomilled ECM השעיות בריכוז של 35 מ&quot;ג / מ&quot;ל, שיעור עירוי של 0.5 מ&quot;ל / דקה, וכן מתח יישומית של 20 קילו. ת: o נוף מאקרוסקופיים.ו microcarriers DAT, DDT, ו DLV hydrated. ברי סולם מייצגים 4 מ&quot;מ. B: תמונות SEM של DAT, DDT, ו microcarriers DLV מראה כי ultrastructure וגודל יכול להשתנות בהתאם למקור ECM. ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> התכונות המכאניות של הפיגומים תלויות מקור ECM, שיטת העיבוד מיושמת (כלומר מיותרת מול cryomilling), ריכוז השעית ECM, ואת טמפרטורת הקיפאון. באופן כללי, את הפיגומים הם רכה וכנועה, עם moduli של יאנג בטווח של 1 - 5 kPa דיווחו על DAT (50 &amp; 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) 29 ו קצף DLV (20 - 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל) 31, ו &lt;1 kPa עבור microcarriers. קצף cryomilled הם בדרך כלל רך הקצף הטחון בשל האופי שיבשו יותר שלהם. מערכות לבדיקות מכאניות Specialized מצוידות בתאי עומס מאוד רגישים נדרשות עבור אפיון מדויק של מאפייני הדחיסה. בדרך כלל, קצפי microcarriers יצטרכו moduli נמוך רקמות decellularized יליד בשל צעדי עיבוד הנוספים המעורבים ייצור כולל עיכול ויצירת הומוגניות אנזימטי, כמו גם את האופי הלא-קוולנטית הצולבים של הפיגומים. עם זאת, זה יכול להשתנות בהתאם הרקמה של עניין. לדוגמה, בעבודה הקודמת, מצאנו כי טחון DAT קצף מפוברק בריכוזים גבוהים ECM (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) היו moduli דומה רקמת שומן ילידי 29. קצף ECM נגזרת rehydrated ו microcarriers ניתן זורע עם תאים בתנאי תרבות סטטי או דינמיים לספק פלטפורמה תומכת תא ללימודי תרבות תאים במבחנה ב ו / or במשלוח תא vivo. בעוד הפיגומים בדרך כלל לתמוך מצורף תא, את יעילות הזריעה תהיה תלויה מקור ECM, גיאומטרית הפיגום הנקבובי, ואת סוג התא של עניין. ככזה, שיטות וצפיפות הזריעה תדרושנה אופטימיזציה בהתאם לתנאים המוגדרים על ידי המשתמש. לקבלת קצף שתוארו לעיל, אנו ממליצים על ריכוז תאי המוצא בטווח של 0.25 - 1 x 10 6 תאים / הפיגום, עם זריעה דינמית על שייקר מסלולית כדי לשפר חדירה לתא. עבור microcarriers, אנו מציעים צפיפות זריעה ראשונית בטווח של 25,000 - 50,000 תאים / מ&quot;ג microcarriers, עם זריעה להתבצע בתנאים דינאמיים בבקבוק התרבות טווה 11. התמונות הראו בתחתית איור 1 לייצג ASCs האדם זורעים על קצף DAT (משמאל) או DAT microcarrier (מימין, prelabeled עם צבע אמין-reactive והופעה כחול 13), דמיינו כפי מיקרו confocalscopy באמצעות כתם כדאי תא פלורסנט (תאי חיים = ירוקים, תאים מתים = אדום; ברי סולם מייצגים 100 מיקרומטר). מיקרוסקופיה Confocal יכולה לשמש כדי לחזות תאים שנזרעו על פני השטח של קצף עד 2 מ&quot;מ עובי, אבל להדמיה לתוך האזורים המרכזיים של הפיגומים מוגבלות מטבעה האטום שלהם. עם זאת, קצפי microcarriers יכולים להתייחס אליהם כאל רקמות פרפין-מוטבע או קריו-נותח במשך היסטולוגית אימונוהיסטוכימיים מנתח לדמיין חלוקת תא ביטוי סמן.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms at JoVE.com

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

מטריקס רקמות ספציפיות (ECM) הוא מתווך המפתח תפקוד התא. מאמר זה מתאר שיטות סינתזת קצף טהור הנגזרות ECM ו- microcarriers כי הם יציבים בתרבות ללא צורך crosslinking כימי עבור יישומי 3D מתקדם במודלי תרבית תאים במבחנה או כפי bioscaffolds פרו-רגנרטיבית.

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

תרבות משלוח Cell mesenchymal סטרומה ב עצמי תנאים: גישה חכמה עבור יישומים אורתופדיות

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

דומה Decellularization של רקמת הלב העוברי ומבוגרים Explants כמו פלטפורמות דמויי תלת-ממד עבור לימודי חוץ גופית

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

בדיית כליות קורטקס חוץ-תאית מטריקס-Derived הידרוג

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...