Name: fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms at JoVE.com

The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ACE222.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alligator clip leads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;470149-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-amylase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101074694</td>
			<td>from Aspergillus aryzae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004251</td>
			<td>With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9879&#160;</td>
			<td>Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomilling system</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td>MM 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8624426</td>
			<td>For lyophilized ECM and bioscaffold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Hams</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6421</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-196-6</td>
			<td>Low form; volume range of 250 - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311425125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Greenfield Specialty Alcohols Inc.</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td>Absolute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>80150</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>37-501-32</td>
			<td>For transferring the foams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer ( -80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EXF40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26D</td>
			<td>To store lyophilized cryomilled ECM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held homogenizer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Speed: 8000 - 30,000 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-261-17</td>
			<td>10 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For electrospraying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750021</td>
			<td>FreeZone4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling chamber</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0213</td>
			<td>25 mL volume recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling balls</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16003-606</td>
			<td>10 mm diameter, stainless steel recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C ABD305185</td>
			<td>For dispensing ECM suspension into moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator shaker&#160;</td>
			<td>SciLogex</td>
			<td>832010089999</td>
			<td>Temperature controlled (37 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>Mandel Scientific</td>
			<td>DRU-4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470019-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21573-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309606</td>
			<td>3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 mL )</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (25 mL)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoopula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89259-968</td>
			<td>For collecting microcarriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10117-490</td>
			<td>Microprocessor controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Gamma High Voltage Research</td>
			<td>ES30P-5W/DDPM</td>
			<td>Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565321</td>
			<td>For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>22258092</td>
			<td>30 cm tubing length, 25 G 3/4 &#34; recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms

सेल समारोह बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) है, जो जटिल ऊतक-विशिष्ट संरचना और वास्तुकला है के साथ बातचीत द्वारा मध्यस्थता है। इस लेख का ध्यान केंद्रित विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में या ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए समर्थक पुनर्योजी scaffolds और सेल वितरण प्रणाली के रूप में उन्नत 3 डी में जैविक रूप से प्रासंगिक substrates के रूप में उपयोग के लिए ईसीएम व्युत्पन्न झरझरा फोम और microcarriers fabricating के लिए तरीकों पर है। एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में decellularized ऊतकों या शुद्ध अघुलनशील कोलेजन का उपयोग करना, तकनीक अनुकूलन geometries के साथ ऊतक विशेष bioscaffolds की एक व्यापक श्रेणी के संश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता। दृष्टिकोण यांत्रिक प्रसंस्करण और एक ईसीएम निलंबन है कि नियंत्रित ठंड और lyophilization प्रक्रियाओं के माध्यम से तीन आयामी फोम या microcarriers निर्माण किया जाता है उपज के लिए हल्के एंजाइमी पाचन शामिल है। ये शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न scaffolds अत्यधिक झरझरा, फिर भी रासायनिक की आवश्यकता के बिना स्थिर रहे हैंअल एजेंट या अन्य additives कि नकारात्मक कोशिकाओं के कार्य को प्रभावित कर सकता crosslinking। पाड़ गुण ऐसे ईसीएम निलंबन एकाग्रता, यांत्रिक प्रसंस्करण विधियों, या संश्लेषण की स्थिति के रूप में अलग-अलग कारकों से कुछ हद तक नियोजित किया जा सकता। सामान्य तौर पर, मचान मजबूत और संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं, और सबसे मानक जैविक assays के लिए ऊतकों के रूप में संसाधित किया जा सकता, कि देशी ईसीएम रचना की नकल करता एक बहुमुखी और उपयोगकर्ता के अनुकूल 3 डी सेल संस्कृति मंच प्रदान करते हैं। कुल मिलाकर, अनुकूलित ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers fabricating के लिए इन सरल तरीकों दोनों जीव और इन विट्रो के लिए और इन विवो अनुप्रयोगों में ऊतक विशेष सेल शिक्षाप्रद प्लेटफॉर्म के रूप में जैव चिकित्सा इंजीनियरों के हित के लिए हो सकता है।

वर्तमान अध्ययन में, हम का प्रदर्शन है कि तकनीक ऊतक विशेष ईसीएम स्रोत के रूप में decellularized ऊतकों की एक किस्म (का उपयोग कर bioscaffolds उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में मानव डैट, सुअर डीडीटी, और सुअर dlv का उपयोग कर ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers गढ़े है चित्रा 1)। दोनों फोम और microcarrier निर्माण के लिए, α-amylase 37 ग्लाइकोलाइटिक एंजाइम के साथ कोलेजन solubilization की Nishihara तकनीक decellularized ऊतक शुरू कर सामग्री है, जो नियंत्रित ठंड और lyophilization प्रक्रियाओं के माध्यम से bioscaffolds के संश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है से एक चिपचिपा ईसीएम निलंबन उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया गया था। फोम निर्माण करने के लिए, decellularized ऊतकों या तो यांत्रिक नख़रेबाज़ या सतह क्षेत्र एंजाइमी पाचन से पहले बढ़ाने के लिए cryomilling के माध्यम से संसाधित किया जा सकता। निम्नलिखित45, उपचार और एकरूपता -amylase, उसके एवज में ईसीएम निलंबन उपयोगकर्ता परिभाषित ढालना है, जो तब स्थिर और lyophilized है में वितरित कर दिया जाता। scaffolds समय की एक विस्तारित अवधि के लिए एक सूखी राज्य में स्थिरतापूर्वक संग्रहित किया जा सकता। सेल संस्कृति के अध्ययन में उपयोग करने से पहले, lyophilized scaffolds एक नियंत्रित पुनर्जलीकरण प्रक्रिया है कि झरझरा और अत्यधिक हाइड्रेटेड सजातीय शुद्ध ईसीएम (चित्रा 3 ए) से व्युत्पन्न फोम पैदावार के अधीन किया जाना चाहिए। फोम बहुत जल्दी rehydrated रहे हैं, तो तेजी से सूजन नाजुक संरचनात्मक विशेषताओं को नुकसान हो सकता, अखंडता और संरचनात्मक पतन की हानि हो जाती है। सामान्य तौर पर, फोम आकार मूल ढालना निम्नलिखित पुनर्जलीकरण द्वारा परिभाषित को बनाए रखने और रासायनिक तिर्यक की आवश्यकता के बिना स्थिर रहे हैं होगा। चित्रा 3 बी प्रतिनिधि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) डैट, डीडीटी की छवियों से पता चलता है, और dlv 35 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता और -80 &amp; # की ठंड के तापमान पर cryomilled ईसीएम के साथ गढ़े फोम176; सी। <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" /> चित्रा 3. प्रतिनिधि -80 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिलीग्राम / एमएल और जमे हुए की एकाग्रता पर डैट, डीडीटी, और Cryomilled ईसीएम निलंबन के साथ dlv Foams गढ़े की छवियाँ। एक: डैट, डीडीटी, और dlv के macroscopic दृश्य 48 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट ढालना पुनर्जलीकरण निम्नलिखित में संश्लेषित फोम मिल्ड। स्केल सलाखों 1 सेमी प्रतिनिधित्व करते हैं। बी: एक सजातीय झरझरा फैटी दिखा डैट, डीडीटी, और dlv फोम की SEM छवियाँ। स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करते हैं। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> Cryomilled ईसीएम निलंबन भी (चित्रा 2 electrospraying तकनीकों के माध्यम से शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न microcarriers उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता </strओंग&gt;)। नियंत्रित पुनर्जलीकरण (चित्रा 4 ए) के बाद व्यास में 500 सुक्ष्ममापी - प्रत्येक ईसीएम स्रोत, निलंबन एकाग्रता, सुई गेज, जलसेक दर, और वोल्टेज के लिए असतत गोलाकार 350 से लेकर microcarriers उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता। microcarriers एक lyophilized राज्य में संग्रहित किया जा सकता है, यह से निपटने है कि वे समाप्त या इथेनॉल में मेजबान निम्नलिखित एक वांछित आकार सीमा को sieved कर रहे हैं में आसानी के लिए सिफारिश की है। SEM इमेजिंग पता चलता है कि microcarrier फैटी decellularized ऊतक स्रोत (चित्रा 4 बी) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" /> चित्रा 35 मिलीग्राम / एमएल, 0.5 एमएल / मिनट की एक आसव दर, और 20 केवी के एक एप्लाइड वोल्टेज की एकाग्रता पर डैट, डीडीटी, और Cryomilled ईसीएम निलंबन के साथ dlv Microcarriers गढ़े की 4. प्रतिनिधि छवियाँ। एक: Macroscopic दृश्य ओहाइड्रेटेड डैट, डीडीटी, और dlv microcarriers च। स्केल सलाखों 4 मिमी प्रतिनिधित्व करते हैं। बी: दिखा रहा है कि फैटी और आकार ईसीएम स्रोत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं डैट, डीडीटी, और dlv microcarriers की SEM छवियाँ। स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करते हैं। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> Scaffolds के यांत्रिक गुणों ईसीएम स्रोत पर निर्भर हैं, प्रसंस्करण की पद्धति लागू (यानी cryomilling बनाम नख़रेबाज़), ईसीएम निलंबन एकाग्रता, और ठंड तापमान। सामान्य तौर पर, मचान, मुलायम और पालन करने वाले 1 की श्रेणी में यंग moduli साथ - (- 50 मिलीग्राम / एमएल 20) 31, और &lt;1 5 किलो पास्कल डैट (50 और 100 मिलीग्राम / एमएल) 29 और dlv फोम के लिए सूचना microcarriers के लिए किलो पास्कल। cryomilled फोम आम तौर वें नरम हैंएक कीमा बनाया हुआ उनके अधिक बाधित प्रकृति के कारण फोम। विशेष यांत्रिक परीक्षण अत्यधिक संवेदनशील लोड कोशिकाओं के साथ सुसज्जित सिस्टम संपीड़न संपत्तियों की सटीक विशेषता के लिए आवश्यक हैं। आमतौर पर, फोम और microcarriers एंजाइमी पाचन और एकरूपता है, साथ ही scaffolds के गैर सहसंयोजक तिर्यक प्रकृति सहित निर्माण में शामिल अतिरिक्त संसाधन चरणों की वजह से देशी decellularized ऊतकों की तुलना में कम moduli होगा। बहरहाल, यह ब्याज की ऊतक के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, पिछले काम में, हमने पाया कि कीमा बनाया हुआ डैट उच्च ईसीएम सांद्रता में गढ़े फोम (100 मिलीग्राम / एमएल) देशी वसा ऊतकों 29 के समान moduli था। Rehydrated ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers स्थिर या गतिशील संस्कृति शर्तों के तहत कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है इन विट्रो सेल संस्कृति के अध्ययन और / ओ के लिए एक सेल सहायक मंच प्रदान करनाविवो सेल वितरण में आर। scaffolds आम तौर पर सेल लगाव समर्थन करते हैं, बोने दक्षता ईसीएम स्रोत, पाड़ ज्यामिति और सरंध्रता, और ब्याज की कोशिका प्रकार पर निर्भर करेगा। जैसे, बोने के तरीकों और घनत्व उपयोगकर्ता परिभाषित शर्तों के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता होगी। 1 x 10 6 कोशिकाओं / पाड़ एक कक्षीय शेकर पर सेल घुसपैठ बढ़ाने के लिए, गतिशील बोने के साथ - के लिए फोम ऊपर वर्णित है, हम एक प्रारंभिक सेल एकाग्रता 0.25 की रेंज में सलाह देते हैं। Microcarriers के लिए, हम 25,000 की रेंज में एक प्रारंभिक बोने घनत्व का सुझाव - 50,000 कोशिकाओं microcarriers की / मिलीग्राम, एक स्पिनर संस्कृति कुप्पी 11 में गतिशील परिस्थितियों में प्रदर्शन किया बोने के साथ। चित्रा 1 के नीचे दिखाया छवियों मानव ASCs, एक डैट फोम (बाएं) या डैट microcarrier पर वरीयता प्राप्त (ठीक है, एक एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई के साथ prelabeled और नीले रंग के 13 प्रदर्शित होने) के रूप में कोंफोकल सूक्ष्म द्वारा कल्पना का प्रतिनिधित्वscopy एक फ्लोरोसेंट सेल व्यवहार्यता दाग का उपयोग कर (जीवित कोशिकाओं = हरे, मृत कोशिकाओं = लाल; पैमाना सलाखों 100 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करते हैं)। कोंफोकल माइक्रोस्कोपी मोटाई में 2 मिमी अप करने के लिए फोम की सतह पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन scaffolds के केंद्रीय क्षेत्रों में दृश्य उनके अपारदर्शी प्रकृति द्वारा सीमित है। हालांकि, फोम और microcarriers ऊतकों के रूप में इलाज किया जा सकता है और तेल-एम्बेडेड या क्रायो-sectioned ऊतकीय और प्रतिरक्षाऊतकरसायन के लिए सेल वितरण और मार्कर अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए विश्लेषण करती है।

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Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

ऊतक विशेष बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सेल समारोह की एक प्रमुख मध्यस्थ है। यह लेख शुद्ध ईसीएम व्युत्पन्न फोम और microcarriers कि इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल में उन्नत 3 डी में अनुप्रयोगों के लिए या समर्थक पुनर्योजी bioscaffolds के रूप में रासायनिक तिर्यक की आवश्यकता के बिना संस्कृति में स्थिर रहे हैं synthesizing के लिए तरीके का वर्णन है।

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