Name: fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms
Uploaded: 2017-04-11T13:00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms at JoVE.com

The Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) have provided funding for this work. The authors would like to acknowledge Dr. Amin Rizkalla for the use of his electrospraying system, the Nanofabrication Facility at Western University for use of SEM imaging equipment, the Mount Brydges Abattoir for the provision of porcine tissue samples, and Drs. Aaron Grant, Brian Evans, and Robert Richards for their clinical collaborations in support of this research.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Внеклеточный матрикс (ECM) , состоит из сложной 3D - сети белков, гликопротеинов и полисахаридов 1. После того, как рассматриваются как преимущественно структурная основа, теперь хорошо известно , что ECM включает в себя широкий спектр биологически активных молекул с важными функциональными ролями 2. Cell-ECM взаимодействия могут направлять выживаемость клеток, адгезии, миграции, пролиферации и дифференцировки 3. В то время как основные классы ECM макромолекул , как правило , хорошо сохраняются через ткани и виды, каждая ткань имеет уникальную матрицу состав и архитектуру 4. В целом, ЕСМ тканеспецифический обеспечивает поучительную микросреду , который опосредует функцию от субклеточного в масштаб ткани / органе 5. Из-за важной роли ЕСМ в опосредовании клеточной функции, там растет интерес к деvelopment из ECM полученных bioscaffolds для применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине. В частности, метод decellularization широко исследован в качестве средства получения ЕСМА из широкого диапазона тканей для использования в качестве материала для строительных лесов регенерации тканей и доставок клеток 5, 6, 7. Decellularization , как правило , включает в себя ряд механических, химических и / или биологических стадий обработки , направленных на удаление клеток и клеточных компонентов, в то время как в идеале вызывая минимальные изменения в 3D - структуры и состава ECM 8. Через рассматривая литературу, различные протоколы decellularization могут быть идентифицированы практически для всех тканей в организме 7. В то время как decellularized ткань может быть использована непосредственно в качестве имплантируемых каркасов или 3D подложек для культивирования клеток, клеточная инфильтрация можетбыть ограничены в тканях с плотной структурой ECM 9. Кроме того, естественная гетерогенность в ECM может привести к вариабельности прикрепления клеток и распределение в пределах decellularized матриц, которые потенциально могли бы повлиять на клеточный ответ 10. В целом, в то время как перспективные для некоторых приложений, применяя decellularized ткани в их интактной форме предлагает ограниченную гибкость в терминах свойств настройки строительных лесов , включая форму, пористость и жесткость, а также способ доставки для применения в естественных условиях. Чтобы обойти эти ограничения, многочисленные исследовательские группы применяют дополнительные методы обработки для создания пользовательских форматов с использованием строительных лесов decellularized ткани в качестве основного материала. В простейшей форме, это может включать в cryomilling decellularized ткани для генерации инъекционных частиц ECM тканеспецифических 11. Эти частицы ECM могут быть включены в качестве клеток-инсctive компонент в композитных каркасах с другими биоматериалов, например, в месте сшивания гидрогели 12, 13, 14. В дополнении к механической обработке, decellularized ткань также может быть подвергнута ферментативным расщепление с протеолитическими и / или гликолитическими ферментами для изготовления ECM полученных гидрогелей, пен, микроносителей, и покрытиями 15, 16, 17, а также для синтеза bioinks для 3D печати 18. В дополнении к ткани-инженерным приложениям, ECM полученных bioscaffolds обладают большим потенциалом для генерации более высокой точности в моделях пробирки для биологических исследований. Существует значительная потребность в разработке 3D - систем клеточных культур , которые лучше резюмировать родной клеточное микроокружение 19. Большинство в пробирке сELL исследование культуры на сегодняшний день проводится на тканевой культуре полистироле (ТКТ), который имеет небольшую корреляцию с биологически сложной и динамичной средой клеточной найденной в живых тканях 20. В то время как удобно для изучения клеточных взаимодействий в контролируемой среде, культивирования клеток на этих упрощенных жестких подложек 2D изменяет прикрепление клеток и морфологию, а также как клетка-клетка и клеток-ECM взаимодействиях 21, 22. Клеточные приспособления , наблюдаемые на 2D ПСКАХ могут воздействовать на внутриклеточные сигнальные путях , которые регулируют различные клеточные функции , включая выживание, пролиферацию, миграцию и дифференциацию, поднимая вопросы актуальности 2D исследований в области моделирования в системах 23 естественных условия. Там было более широкое признание , что клеточное поведение может значительно варьироваться в 2D по сравнению с системами 3D 24, и что биохимические и биomechanical сигнализация с ECM являются ключевыми медиаторами клеточной функции 25. Многие группы пытались преодолеть ограничения, установленные 2D систем путем покрытия ТКТ с компонентами ECM, такие как коллаген, ламинин, фибронектин и. Хотя эти стратегии могут улучшить прикрепление клеток и могут изменить клеточные ответы, эти модели остаются ограничены их 2D - конфигурация, не имитирует сложную пространственную организацию или биохимию родной ECM 26, 27. Наша биоинженерия лаборатория была заинтересована в разработке ECM производных bioscaffolds в качестве субстратов для 3-D культуры клеток и тканей инженерных приложений. В частности, мы были пионерами использования decellularized жировой ткани (DAT) в качестве подмостей платформы для жировых регенераций 28. Кроме того, мы установили методы синтеза 3D микроносителей и пористых пенопластов с использованием DАТ расщепляли протеолитического фермента пепсина или гликолитического фермента α-амилазы 29, 30, 31. Следует отметить, что мы продемонстрировали во всех этих форматах строительных лесов, что полученную из жировой ткани ЕСМ обеспечивает индуктивную микросреду для адипогенной дифференцировки стволовых / стромальных клеток человека, полученных из жировой ткани (ИСС) в культуре. Совсем недавно мы расширили наши методы изготовления для создания 3D пористых пенопластов из α-амилаза-переваренных свиного decellularized левого желудочка (DLV) (методы decellularization , адаптированные из Уэйнрайт и др. 32), и показали , что они обеспечивают вспомогательную платформу для индуцирования раннего cardiomyogenic выражение маркеров в человеческом перикарде жира , полученные ИССАХ 31. В данной статье подробно описаны методы синтеза не-химически сшитые 3D пористых пен и микроносители, полученные чистоиз альфа-амилазы-переваренная ECM для использования в качестве биологически сложная 3D в пробирке субстратов для культивирования клеток и в качестве биоматериалов для регенерации тканей. Теоретически, любой источник ЕСМ, содержащий коллаген с высокой молекулярной массы могут быть использованы в качестве исходного материала для этих методов. Для того, чтобы продемонстрировать гибкость данного подхода, методы были применены для создания тканеспецифического bioscaffolds с использованием человеческого DAT, свиной decellularized кожной ткань (ДДТ) 8, и свиной DLV в качестве репрезентативных примеров. На рисунке 1 представлен визуальный обзор процесса изготовления для ECM полученных пен и микроносителей. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig1.jpg" /> Рисунок 1. Обзор методов для производства Тканеспецифическая ECM полученных пен и микроносителей. 1. Decellularized ткани, полученной в соответствии с установленной Decellularization протоколы, могут быть использованы для изготовления bioscaffold тканеспецифической ECM происхождения. Макроскопические изображения показаны гидратированного человека DAT (полученного , как описано в Flynn 2010 28), свиного ДДТ (полученного , как описано в Reing, JE, и др. 2010 8), и свиной DLV (полученного , как описано в Wainwright и др. 2010 32 ), в качестве репрезентативных примеров источников ECM, которые могут быть использованы в качестве исходных материалов. Масштабные столбики представляют 3 см. 2. decellularized ткань лиофилизировала, а затем механически 3. фарша. Масштабные полоски обозначают 1 см. 4. рубленого ЕСМ может быть затем cryomilled, который является необязательным для изготовления пены, но необходим для синтеза микроносителя. Шкала бар представляет собой 3 мм. 5. рубленого или cryomilled ЕСМ затем переваривают с альфа-амилазы и гомогенизируют для создания гомогенной суспензии ECM. Шкала бар представляет собой 1 см. <strOng&gt; 6а) Для изготовления пены, ЕСМ суспензия переносит в определенном пользователе форме, замораживают и лиофилизует , чтобы создать пористый 3D леску с хорошо определенной геометрией. Шкала бар представляет собой 1 см. 6б) Для изготовления микроносителя, то cryomilled ЕСМА суспензия electrosprayed для генерации дискретных сферических микроносителей. Шкала бар представляет 2 мм. 7. Пенопласты и микроносители могут быть затем постепенно регидратация и засевали клетки. Представительные изображения показаны человеческие ИСС (жизнеспособные клетки = зеленый) высевали на ДАТЫ пены (слева) и DAT микроносителе (справа). Шкала столбцы представляют 100 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>ACE222.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alligator clip leads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;470149-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-213-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-amylase&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>101074694</td>
			<td>from Aspergillus aryzae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CPA225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004251</td>
			<td>With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes (50 mL)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9879&#160;</td>
			<td>Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomilling system</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td>MM 400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>8624426</td>
			<td>For lyophilized ECM and bioscaffold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Hams</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6421</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-196-6</td>
			<td>Low form; volume range of 250 - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311425125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Greenfield Specialty Alcohols Inc.</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td>Absolute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>80150</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>37-501-32</td>
			<td>For transferring the foams</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (-20 &#176;C)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer ( -80 &#176;C)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EXF40086A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26D</td>
			<td>To store lyophilized cryomilled ECM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held homogenizer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-359-251</td>
			<td>Speed: 8000 - 30,000 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-261-17</td>
			<td>10 X 95 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For electrospraying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7750021</td>
			<td>FreeZone4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling chamber</td>
			<td>Retsch</td>
			<td>02.462.0213</td>
			<td>25 mL volume recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milling balls</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16003-606</td>
			<td>10 mm diameter, stainless steel recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>C ABD305185</td>
			<td>For dispensing ECM suspension into moulds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital incubator shaker&#160;</td>
			<td>SciLogex</td>
			<td>832010089999</td>
			<td>Temperature controlled (37 &#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for proliferation media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid XP</td>
			<td>Mandel Scientific</td>
			<td>DRU-4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470019-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retort stand clamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21573-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety-Lok Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309606</td>
			<td>3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (10 mL )</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (25 mL)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic&#160;</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>10049-21-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scoopula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89259-968</td>
			<td>For collecting microcarriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10117-490</td>
			<td>Microprocessor controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage power supply</td>
			<td>Gamma High Voltage Research</td>
			<td>ES30P-5W/DDPM</td>
			<td>Capable of recommended 15 - 25 kV voltage range</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565321</td>
			<td>For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged infusion set</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>22258092</td>
			<td>30 cm tubing length, 25 G 3/4 &#34; recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of extracellular matrix-derived foams and microcarriers as tissue-specific cell culture and delivery platforms

Функция клеток опосредована взаимодействием с внеклеточным матриксом (ECM), который имеет сложную тканеспецифическую композицию и архитектуру. Основное внимание в этой статье о методах изготовления ECM полученного пористых пен и микроносителей для использования в качестве биологически соответствующие субстратов в передовых 3D в пробирке моделей клеточных культур или как про-регенеративные подмостей и системы доставки клеток для тканевой инженерии и регенеративной медицины. Использование decellularized ткани или очищенный нерастворимый коллагена в качестве исходного материала, методики могут быть применены для синтеза широкого спектра тканеспецифического bioscaffolds с настраиваемой геометрией. Подход включает механическую обработку и мягкое ферментативное переваривание с получением суспензии ЕСМА, который используется для изготовления трехмерной пены или микроносителей через контролируемые процедуры замораживания и лиофилизации. Эти чистый ECM полученных каркасы имеют высокую пористость, но стабильные без необходимости химичесааль сшивающие агенты или другие добавки, которые могут отрицательно воздействовать на функцию клеток. Свойства строительных лесов могут быть настроены в некоторой степень различных факторов, такие как концентрация ECM суспензии, механические методы обработки или условия синтеза. В общем, каркасы надежны и просты в обращении и могут быть обработаны в качестве тканей для большинства стандартных биологических анализов, обеспечивая универсальную и удобную платформу 3D культуры клеток, который имитирует нативный состав ECM. В целом, эти простые методы для изготовления пользовательского ECM полученных пенопластов и микроносителей могут представлять интерес для обоего биологов и биомедицинских инженеров как ткан-специфических клетки-поучительны платформы для ин витро , так и в естественных условиях применения.

В настоящем исследовании мы изготовили ECM полученных пенопластов и микроносители с использованием человеческих DAT, свиной ДДТ и свиной DLV в качестве типичных примеров, демонстрирующих, что методы могут быть применены для создания bioscaffolds тканеспецифического с использованием различных decellularized тканей в качестве источников (ECM Рисунок 1). Для обоих пены и микроносителя изготовления, метод Нисихара коллагена солюбилизации с гликолитического фермента альфа-амилазы 37, выполненный с возможностью формирования вязкого ECM суспензии из decellularized ткани исходных материалов, который используется для синтеза bioscaffolds посредством контролируемых процедур замораживания и лиофилизации. Для изготовления пенопластов, в decellularized ткани могут быть обработаны либо через механические или измельчения cryomilling, чтобы увеличить площадь поверхности перед ферментативным расщеплением. Следующий45; амилазы обработки и гомогенизации, в результате ЕСМ суспензию разливают в определенной пользователем пресс-формы, который затем замораживают и лиофилизируют. Эти каркасы могут быть сохранены стабильно в сухом состоянии в течение длительного периода времени. Перед использование в исследованиях на культуре клеток, лиофилизированные каркасы должны быть подвергнуты контролируемым процесс регидратации , который дает пористые и высоко гидратированные однородные пенопласты , полученным из чистого ECM (Рисунок 3A). Если пены регидратации слишком быстро, быстрое набухание может повредить тонкие структурные особенности, что приводит к потере целостности и разрушения конструкций. В общем, пены будет сохранять форму, определяемую исходной формы следующей регидратации и являются стабильными без необходимости химического сшивания. Фигура 3В показывает представитель сканирующего электронного микроскопа (SEM) изображений DAT, ДДТ и DLV пенопласты изготовлены с cryomilled ECM при концентрации 35 мг / мл и при температуре замораживания от -80 &amp; #176; С. <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig3.jpg" /> Рисунок 3. Типичные Изображения DAT, ДДТ и DLV пеноматериалов с Cryomilled сфабриковано ECM Суспензии при концентрации 35 мг / мл и замораживали при -80 ° С. А: Макроскопический вид на DAT, ДДТ и DLV размалывают пенопластов , синтезированные в 48-луночный планшет для тканевых культур плесени следующей регидратации. Масштабные полоски обозначают 1 см. Б: СЭМ изображение пенопластов ДАТ, ДДТ и DLV , показывающее однородные пористые ультраструктуры. Шкала столбцы представляют 100 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> В cryomilled ECM суспензии могут также быть использованы для создания чистого ECM полученных через микроносители методов electrospraying (Рисунок 2 </strОнг&gt;). Для каждого источника ECM, концентрации суспензии, иглы калибра, скорости инфузии, и напряжений может быть настроено для генерации дискретных сферических микроносителей в диапазоне от 350 - 500 мкм в диаметре следующих контролируемой регидратации (фиг.4А). В то время как микроносители можно хранить в лиофилизированном состо нии, рекомендуются для простоты обработки, что они разливают или просеивают до желаемого диапазона размера следующих ресуспендирований в этаноле. СЭМ изображение позволяет предположить , что микроноситель ультраструктура может варьироваться в зависимости от источника decellularized ткани (рис 4В). <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/55436/55436fig4.jpg" /> Рисунок 4. Представитель Изображения DAT, ДДТ и DLV микроносители изготовлены с Cryomilled ECM Суспензией при концентрации 35 мг / мл, вливание скорости 0,5 мл / мин, и приложенное напряжение 20 кВ. A: Макроскопический вид ое гидратированных микроносителями DAT, ДДТ, и DLV. Масштабные столбики представляют 4 мм. Б: СЭМ изображение микроносителей ДАТ, ДДТ и DLV , показывающие , что ультраструктуры и размер могут варьироваться в зависимости от источника ECM. Шкала столбцы представляют 100 мкм. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55436/55436fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Механические свойства каркасов зависят от источника ECM, метод обработки применяется (т.е. мясорубки по сравнению с cryomilling), концентрацию ЕСМ суспензии и температуры замерзания. В общем, каркасы являются мягкими и совместимый с модулями Юнга в диапазоне от 1 - 5 кПа сообщили в DAT (50 &amp; 100 мг / мл) 29 и DLV пены (20 - 50 мг / мл) 31, а &lt;1 кПа для микроносителей. В cryomilled пены обычно мягче гоН. фарш пенопласты из-за их более нарушенный характер. Специализированные механические испытательные системы, оснащенные высокочувствительными тензодатчики необходимы для точных определения характеристик сжимающих свойств. Как правило, пена и микроносители будут иметь более низкие модули, чем нативные decellularized ткани из-за дополнительные стадии обработки, участвующих в производстве, включая ферментативное расщепление и гомогенизацию, а также нековалентно сшитую природу каркасов. Тем не менее, это может варьироваться в зависимости от ткани, представляющей интерес. Например, в предыдущей работе, мы обнаружили , что измельченная ДАТ пенопластов изготовленные при высоких концентрациях ECM (100 мг / мл) были подобные модули к родной жировой ткани 29. Регидратированный ECM полученных пены и микроносители могут быть засевают клетки в статических или динамических условиях культивирования , чтобы обеспечить платформу клеток поддерживающей для исследований в пробирке для культивирования клеток и / ог в естественных условиях доставки клеток. В то время как каркасы в целом поддерживают прикрепление клеток, эффективность посева будет зависеть от источника ECM, геометрии строительных лесов и пористости, а также от типа клеток, представляющего интереса. Таким образом, способы посева и плотности потребует оптимизации в зависимости от заданных пользователем условий. Для получения пены описана выше, мы рекомендуем концентрацию начальной ячейки в диапазоне от 0,25 - 1 × 10 6 клеток / помоста, с динамическим высевом на орбитальном шейкер для усиления клеточной инфильтрации. Для микроносителей, мы предлагаем начальную плотность посева в диапазоне от 25000 - 50000 клеток / мг микроносителей, с посевом , выполняемым в динамических условиях во вращающейся культуральной колбе 11. Изображения , показанные в нижней части фиг.1 , представляют собой человеческие ИСС высевали на DAT пены (слева) или DAT микроносителя (справа, предварительно меченных с амином-реактивный краситель и появление синего 13), как и визуализированы с помощью конфокальной микроскопии с использованием флуоресцентного жизнеспособности клеток пятна (живые клетки = зеленые, мертвые клетки = красный; чешуйчатые столбцы представляют 100 мкм). Конфокальная микроскопия может быть использована для визуализации клеток, посеянных на поверхности пен до 2 мм в толщине, но визуализация в центральные районы каркасов ограничена их непрозрачного характером. Тем не менее, пену и микроносители можно рассматривать как ткань и парафин или крио-секционный для гистологического и иммуногистохимического анализа, чтобы визуализировать распределение клеток и экспрессии маркеров.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms at JoVE.com

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Тканеспецифический внеклеточный матрикс (ЕСМ) является ключевым медиатором клеточной функции. В этой статье описаны методы синтеза чистых ECM полученных пенопластов и микроносители , которые являются стабильными в культуре без необходимости химического сшивания для применения в передовых 3D моделей в пробирке клеточных культур или в качестве про-регенеративные bioscaffolds.

Изготовление внеклеточного матрикса, производных Пены и микроносителями как Тканеспецифическая культуре клеток и платформ доставки

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

Microfabricated платформы для механическим динамическим культуре клеток

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

Вращающийся культуре клеток системы по правам культуры клеток: Человеческие клетки трофобласта в качестве модели

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Строительные леса Self-отчетности для 3-Dimensional культуре клеток

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Сотовый Сжатие как Robust, микрофлюидных внутриклеточного Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Мезенхимальных стромальных Культура клеток и доставки в аутологичных условиях: Интеллектуальный подход для протезных применений

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Настраиваемый гидрогели от легочного внеклеточной матрицы для 3D клеточных культур

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Синтез биосовместимых жидкого кристалла эластомерных пен, как Cell Каркасы для 3D-пространственных культур клеток

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Сопоставимых Decellularization плода и взрослых сердечной ткани эксплантов как 3D-как платформы для в исследованиях in Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Рекомбинатные коллаген я пептидные Microcarriers для расширения клеток и их потенциального использования в качестве системы доставки клеток в биореакторе модель

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Изготовления внеклеточная матрица производные гидрогеля почек коры

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...