Name: an in vitro organ culture model of the murine intervertebral disc
Uploaded: 2017-04-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل مركز جامعة واشنطن العضلية الهيكلية البحوث (NIH P30 AR057235)، مركز التصوير الجزيئي (NIH P50 CA094056)، ميكانيكا الأحياء التدريب غرانت (NIH 5T32EB018266)، NIH R21AR069804، والمعاهد الوطنية للصحة K01AR069116. فإن الكتاب أود أن أشكر باتريك وونغ لإسهاماته في مجال جمع البيانات.

وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لجامعة واشنطن في لجنة الدراسات الحيوانية لويس القديس. 1. الحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على سلالتين من الفئران: 10 الاسبوع القديمة BALB / ج (ن = 6، BALB-M، BALB / cAnNTac) ...

<ol>
	<li>Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+low+back+pain+cost+of+illness+studies+in+the+United+States+and+internationally.">A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally.</a> Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).</li><li>Urban, J., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+the+intervertbral+disc.">Degeneration of the intervertbral disc.</a> Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).</li><li>Mirza, S. K., White, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+intervertebral+disc+and+pathophysiology+of+herniated+disc+disease.">Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease.</a> J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).</li><li>Acaroglu, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+and+aging+affect+the+tensile+behavior+of+human+lumbar+anulus+fibrosus.">Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus.</a> Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).</li><li>Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+changes+in+the+structure+and+inflammatory+response+of+the+intervertebral+disc+due+to+stab+injury+in+a+murine+organ+culture+model.">Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model.</a> J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).</li><li>Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathomechanisms+of+discogenic+low+back+pain+in+humans+and+animal+models.">Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models.</a> Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).</li><li>Pelle, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+studies+of+the+intervertebral+disc:+A+novel+murine+intervertebral+disc+model.">Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model.</a> PLoS ONE. 9 (12), (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+investigation+of+intervertebral+disc+degeneration+produced+by+needle-stab+injury+of+the+rat+caudal+spine.">Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine.</a> J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).</li><li>Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-throughput+phenotyping+of+the+viscoelastic+behavior+of+whole+mouse+intervertebral+discs+using+a+novel+method+of+dynamic+mechanical+testing.">The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing.</a> J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).</li><li>Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+the+contrast-enhanced+microCT+imaging+of+murine+intervertebral+discs.">A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).</li><li>Pasparakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tissue+homeostasis+by+NF-kappaB+signalling:+implications+for+inflammatory+diseases.">Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases.</a> Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).</li><li>O&#8217;Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+animals+used+in+disc+research+to+human+lumbar+disc+geometry.">Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li><li>Lee, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc:+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies.">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine. 31, 515-522 (2006).</li><li>Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Intact+Bovine+Tail+Intervertebral+Discs+for+Organ+Culture.">Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture.</a> J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).</li><li>Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+mouse+partially+models+the+aging+human+spine:+lumbar+and+coccygeal+disc+height,+composition,+mechanical+properties,+and+Wnt+signaling+in+young+and+old+mice.">The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice.</a> J Appl Physiol. 116 (12), (2014).</li></ol>

ويحدد هذا البروتوكول ثقافة الجهاز من الاتحاد السوفياتي السابق الفئران مع التركيز على رصد التغيرات البيولوجية في IVD. نجاحها في الحفاظ على هذه الثقافات يتطلب تقنيات معقمة دقيقة. على وجه الخصوص، تشريح الخطوات 2،1-2،6 وثقافة الخطوات من 3،1-3،6 يحتاجون إلى ?...

آلام أسفل الظهر (LBP) هو العامل الرئيسي للإعاقة العالمية وفقدان الإنتاجية في مكان العمل، وينفق الاميركيون وحدها ما يزيد على 50 مليار دولار على العلاج LBP 1. على الرغم من أن انتشارا، مسببات LBP لا تزال معقدة ومتعددة العوامل. ومع ذلك، القرص الفقرية (IVD) انحطاط هو من بين عوامل الخطر الأكثر أهمية ليرة لبنانية (2). ويتكون من ثلاثة IVD المجهرية: والخارجي بالطوق تليف (AF)، ونواة اللبية الداخلية (NP)، واثنين من الصفائح الطرفية الغضروفية التي ساندويتش الهيكل كله قريب وبشكل أقصى 3. مع الشيخوخة وانحطاط، ومكونات IVD تتغير هيكليا، إنشائي، وميكانيكيا 4. وتشمل هذه التغييرات فقدان البروتيوغليكان والماء في NP، انخفض ارتفاع القرص، وتدهور الكفاءة الميكانيكية 5. هذه التعديلات هيكثيرا ما يكون مصحوبا السيتوكينات التي تعزز استجابة التهابية، وكذلك العدلة والجذر الظهري العقدة اقتحام الفضاء المشترك وبلغت ذروتها في سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى أعراض LBP 6. دراسة آليات IVD انحطاط هو التحدي في البشر لأنه غالبا ما يكون من غير الممكن عزل سبب انحطاط قبل حدوث آلام أسفل الظهر. وهكذا، فإن المقاربة الاختزالية تبسيط النظام التجريبي وصولا الى الجهاز الخاص بالتحاليل المخبرية يسمح الآلية صقل المتغيرات السببية وفحص آثار المصب من 5. يتم تقليل النظام فقط سكان الخلية الأم والمحيطة المصفوفة خارج الخلية، مما يمكن تفسير مباشر للآثار مؤثرات الخارجية على انحطاط IVD. وعلاوة على ذلك، وانخفاض التكلفة وقابلية للنماذج الفئران، فضلا عن عدد كبير من الحيوانات المعدلة وراثيا 7، تسمح رانه فحص المستهدفة السريع لآليات التنكسية IVD والعلاجات المحتملة. هنا، نحن تصف نظام الجهاز ثقافة الفئران التي تحفظ IVD الخلوية والأنسجة الاستقرار أكثر من 21 أيام، مع التركيز بشكل خاص نظرا لأنماط التماثل الساكن والميكانيكية والهيكلية، والتهابات في IVDs. باستخدام هذه الطريقة، ونحن نراقب التغيرات الوظيفية للIVDs &#39;في الناجمة عن طعنة نموذج إصابة 8 إلى فهم آليات وراء تنكس القرص. وعلاوة على ذلك، نحن تصف العديد من التطبيقات لهذا الأسلوب الثقافة الجهاز لإجراء مزيد من الدراسات بما في ذلك على النقيض محسنة التصوير microCT وثلاثي الأبعاد النمذجة عالية الدقة من IVD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP92096</td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP92024</td>
			<td>Used for organ culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ml pipettes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP94024</td>
			<td>Used for organ culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml pipettes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP94010</td>
			<td>Used for organ culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipettes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP94005</td>
			<td>Used for organ culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottle top filters, 22um</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP99505</td>
			<td>Used for filter media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ul pipette tips</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>NP89140098</td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ul pipette tips</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>NP89140900</td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 ul pipette tips</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>NP89140920</td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM /F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330032</td>
			<td>Used for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiray 350</td>
			<td>Guebert</td>
			<td>19133341</td>
			<td>Used for contrast enhanced microCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442</td>
			<td>Used for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Used for culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrazolium Blue Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4375</td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Luciferin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6152</td>
			<td>Used for bioluminescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chondroitin Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9819</td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Phosphomolybdic Acid Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT152</td>
			<td>Used for contrast enhanced microCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8884</td>
			<td>diluted to .1% concentration (in water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7258</td>
			<td>.001% concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain from papaya latex</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P3125</td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>234790</td>
			<td>Adhesive&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>S348903</td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDent</td>
			<td>ActiveLife</td>
			<td></td>
			<td>For mechanical testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam503</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivaCT40</td>
			<td>Scanco</td>
			<td></td>
			<td>MicroCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Denver Instrument Company</td>
			<td>A-200DS</td>
			<td>Analytical balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator HERAcell 150i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Organ Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scope</td>
			<td>VistaVision</td>
			<td></td>
			<td>Used during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Micrometer</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>LK-081</td>
			<td>Measuring disc height</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5810 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Used for biochemical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>RM2255</td>
			<td>Used for histology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>For statistics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB R2014a</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>For modeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osiri-LXIV</td>
			<td>Pixmeo</td>
			<td></td>
			<td>Open Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeshLab v1.3.3</td>
			<td>Visual Computing Lab - ISTI - CNR</td>
			<td></td>
			<td>Open Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreView/FEBio 2.3</td>
			<td>Utah MRL &#38; Columbia MBL</td>
			<td></td>
			<td>Open Source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Windows</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>15000-02</td>
			<td>Or any nice pair of spring scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp&#160; (small)</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp&#160; (larger)</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>14060-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>11252-40</td>
			<td>At least 2; can also use #3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>11150-10</td>
			<td>At least 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps, serrated</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503719-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps, teeth</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #3</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle - #4</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>10004-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades - #23</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>10023-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins , size 000</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;&#160;</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needles</td>
			<td>BD305109</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro organ culture model of the murine intervertebral disc

الفقرية القرص (IVD) انحطاط هو مساهم كبير في آلام أسفل الظهر. وIVD هو مفصل ليفي غضروفي التي تعمل على نقل وتخفيف الأحمال في العمود الفقري. تتألف IVD من نواة اللبية-بروتيوغليكان الغني (NP) والكولاجين الغنية بالطوق تليف (AF) تقع في نهاية لوحات الغضروفية. جنبا إلى جنب مع فقرات المجاورة، وهيكل فقرات-IVD يشكل وحدة العمود الفقري وظيفية (الاتحاد السوفياتي السابق). هذه المجهرية تحتوي على أنواع الخلايا الفريدة فضلا عن مصفوفات خارج الخلية فريدة من نوعها. الثقافة الجهاز كاملة من الاتحاد السوفياتي السابق يحافظ على مصفوفة الأم خارج الخلية، الظواهر تمايز الخلايا، والتفاعلات الخلوية مصفوفة. وهكذا، تقنيات زراعة الأعضاء هي مفيدة بشكل خاص للتحقيق في الآليات البيولوجية المعقدة للIVD. هنا، نحن تصف النهج الإنتاجية العالية لزراعة كله قطني FSUs الفأر الذي يوفر منصة مثالية لدراسة آليات المرض والعلاجات للIVD. وعلاوة على ذلك، نحن تصف الصورةتطبيقات everal التي تستخدم هذه الطريقة الثقافة الجهاز لإجراء مزيد من الدراسات بما في ذلك على النقيض محسنة التصوير microCT وعالية الدقة النمذجة عنصر محدود ثلاثي الأبعاد من IVD.

الأرقام 2-3 تظهر نتائج ممثل التوزيع بروتيوغليكان، والتعبير NF كيلوبايت، وصلابة، اللزوجة، ارتفاع القرص، والوزن الرطب للIVDs الماوس مثقف. إذا مثقف بشكل صحيح، يجب المعلمات IVD من السيطرة على المجموعة لن تكون مختلفة كثيرا عن مجموعة جديدة. في حالة إصابة ثقافة أو خلاف...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc at JoVE.com

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

الثقافة الجهاز كاملة من القرص الفقرية (IVD) يحافظ على مصفوفة الأم خارج الخلية، خلية الظواهر، والتفاعلات الخلوية مصفوفة. نحن هنا وصف نظام الثقافة IVD باستخدام الماوس قطني وIVDs الذيلية في وحدات العمود الفقري وظيفية، والعديد من التطبيقات التي تستخدم هذا النظام.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج الثقافة الجهاز من الفئران فقرات القرص

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

The overall goal of this in vitro organ culture method is to maintain homeostasis and observe the inflammatory response of intervertebral discs in their native anatomy. This method can help answer key questions in intervertebral disc degeneration and low back pain, and it may aid in discovering new drugs and therapies. The main advantage of this method is that it can be done rapidly while maintaining the anatomy of the disc and other tissues.Generally, individuals new to this method will struggle, because it is hard to maintain sterility, as any contamination my compromise the experimental results. Because of the minute size of mouse intervertebral discs, visual demonstration of the dissection and organ culture steps is critical. Before beginning this protocol, purchase two strains of ten-week-old mice, BALB/c and transgenic animals with the luciferase gene expressed under the control of the nuclear factor kappa B promoter, bred on the BALB/c genetic background.To begin, bathe the previously euthanized mouse in 70%ethanol for two minutes to ensure its skin and coating is disinfected for the dissection. Then, make a longitudinal cut in the animal's dorsal skin using small dissection scissors to expose the body cavity. Proceed with two longitudinal vertical cuts, starting from the L1 vertebrae to the C8 vertebrae on both sides of the spine.Use a scalpel, fine forceps, and fine dissection scissors to carefully remove the L1 to C8 spine fragment from the mouse body cavity. Excise any excess soft tissues that surround the spine. Be careful not to scrape or injure the intervertebral disc, or IVD, on the ventral side.Divide the spinal column into functional spine units, or FSUs, comprising vertebrae disc vertebrae fragments. Then, wash the obtained FSUs in Hank's balanced salt solution supplemented with antibiotics for two minutes. Now that FSUs are washed, assign them randomly to three experimental groups marked as fresh, control, and stab.Immediately after preparation, freeze the fresh FSUs in liquid nitrogen, and store the samples in a negative 20 degree Celsius freezer. To initiate the organ culture, use ten-milliliter serological pipettes to add two milliliters of DMEM/F-12 culture medium into each well of a 24-well culture plate. Then, transfer each dissected and washed FSU to an individual well of the 24-well plate filled with media.Incubate the 24-well plate containing the samples in a disinfected incubator at 37 degrees Celsius, 5%carbon dioxide, 20%oxygen, and greater than 90%humidity. After culturing the samples for 24 hours, use a sterile 27-gauge needle to puncture the annulus fibrosus so as to induce mechanical injury in the samples from the stab group. Every 48 hours, change the media by transferring the samples with tweezers to a new 24-well plate filled with media.On the twenty-first day of culture, transfer all samples into media containing 0.75 milligrams per milliliter nitroblue tetrazolium chloride, and incubate them for an additional 24 hours. After 24 hours of incubation, freeze all the FSUs in liquid nitrogen, and store the samples in a negative 20 degree Celsius freezer for further testing. To assess NF kappa B expression, add ten microliters of a one milligram per milliliter luciferin solution to each well containing FSU isolated from an animal transgenic for NF kappa B luciferase.Then, incubate the plate in a sterile incubator at 37 degrees Celsius for ten minutes. Under the dissection microscope, use a scalpel and tweezers to remove the bony vertebral bodies from each FSU sample. Be careful not to damage or detach the cartilaginous endplates from the IVD.Then, using cyanoacrylate glue, attach the isolated IVDs to a one centimeter by one centimeter by 0.2 centimeter aluminum plate. Subsequently, measure the disc height and width with a laser micrometer, and calculate the disc height ratio as described in the text protocol. Next, transfer the samples to the phosphate-buffered saline bath positioned under the compression machine, and preload the disc to 0.02 newtons.To cyclically compress the disc, apply 20 cycles of a sinusoidal waveform at 1 hertz and conduct three trials for both 1%strain level and 5%strain level. Record the load and displacement data to calculate the average stiffness and loss tangent of the IVD. Presented here are images of the bioluminescent signal corresponding to NF kappa B expression in control and stab samples.The signal in both control and stab samples indicates that the IVD cultured in vitro remains viable and responsive. Additionally, stab samples reveal increased NF kappa B expression compared to the control on days one, five, 13, and 19. Further mechanical testing conducted for the IVDs cultured in vitro confirms that culture conditions do not influence the properties of the control IVDs, such as disc height ratio, stiffness, or loss tangent.In addition, the decreased disc height ratio, stiffness, and loss tangent observed for the stab group further confirms viability and responsiveness of the IVD cultured in vitro. Once this technique has been mastered, up to 18 samples can be prepared for culture in an hour. While attempting this procedure, it's important to work slowly and carefully to ensure that sterility is maintained.Following this procedure, more mechanistic studies can be performed using genetically modified mice to get a better understanding of disc degeneration. This technique can also be used to explore various treatments and therapies for low back pain. After watching this video, you should have a good understanding of how to prepare and culture mouse functional spine units for experimental conditions.Don't forget that working in a lab can be hazardous, and precautions, including personal protective equipment, should always be taken while performing this procedure.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

إعداد أقراص سليمة الذيل البقري الفقرية للثقافة الجهاز

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting  vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give  ...

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

هندسة الأنسجة من الأمعاء في نموذج الفئران

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

في المختبر خلية الثقافة نموذج لاستنشاق الفحوصات الكيميائية السامة

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

ديسيلولاريزيشن قلب البشري برمته داخل حقيبة الضغط في اتجاه معكوس

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

منصة تقنية مفتوحة المصدر لتصنيع نماذج ثقافة 3D القائمة على الهيدروجيل بطريقة آلية وموحدة

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

Transplantation of a 3D Bioprinted Patch in a Murine Model of Myocardial Infarction

زرع رقعة مطبوعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد في نموذج مورين من احتشاء عضلة القلب

Testing regenerative properties of 3D bioprinted cardiac patches in vivo using murine models of heart failure via permanent left anterior descending (LAD) ...