Name: initial evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides for increasing cellular accumulation and improving tumor targeting
Uploaded: 2018-03-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Cancer Research Society (Canada) og CIMS. Forfatterne takke Dr. Samia Ait-Mohand og Jean-Francois Beaudoin for bistand. Dr. Angel Lopez (Universitet i South Australia) for mAb A14.

De i vivo dyreforsøg beskrevet blev udført efter en godkendt protokol og under de etiske retningslinjer for Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke etiske komité for animalsk eksperimenter.
1. antistof peptid konjugation
Bemærk: ChAcNLS kan syntetiseres ved enhver kommerciel peptid producent eller Universitet-tilknyttede peptid syntese serviceplatform. Syntesen af ChAcNLS kan findes i reference 34. For procedurer 1 og 2 brug...

Større mål af systemisk levering af anticancer-midler er at øge ophobning på tumor site, og optagelse i kræftceller og formindske uønskede bivirkninger i sundt væv. AC målrettet levering af molekylære nyttelast at tumorceller er en meget lovende metode til at behandle og afsløre tumorer. Men manglen effekt skyldes endosome fastklemning og ned stream lysosomale nedbrydning forbliver en vigtig udfordring. Mens denne protokol udnytter ChAcNLS peptid som et eksempel for opførelsen af næste generation ACs, kan de ...

Antistof-konjugater (ACs) er biopharmaceuticals, der modning i en transformativ klasse af effektive lægemidler til at forbedre kræftbehandling og til påvisning af tumorer. Består af et monoklonalt antistof (mAb) konjugeret til molekylære nyttelast som radioisotoper, små molekyler og biologiske toksiner, ACs er i stand til at levere disse payloads til kræftceller med udsøgte mål antigen affinitet og specificitet. Dermed ACs har potentiale til at reducere uspecifik toksicitet og øge nyttelasten aktivitet på webstedet tumor. Terapeutisk, er ACs transport af cytotoksiske små molekyler (ofte refereret til som antistof-drug konjugater) blevet godkendt til behandling af patienter med brystkræft og Hodgkins lymfom, som ikke har konventionelle behandlinger 1, 2. Derudover ACs transport af radioaktive isotoper (ofte kaldet radioimmunoconjugates) er også under udvikling. En AC transporterer en radioisotop for billedbehandling er godkendt til at identificere prostata kræft metastaser 3. Med mange mere terapeutisk ACs forelægges til godkendelse 4, er optimisme høj for fremtiden i ACs at forbedre kræft pleje 5.
Ikke desto mindre, når levere kemoterapeutika eller radioisotoper, ACs har svært ved effektivt akkumulere disse nyttelast inde i target-cellerne. Dette aspekt bidrager betydeligt i mange tilfælde i den manglende evne til i ACs at give langvarig sygdomsfri overlevelse eller høj kontrast tumor imaging 6,7. I almindelighed, når ACs binde deres mål antigener er de internaliseres gennem en proces kendt som receptor-medieret endocytose. ACs er derefter fanget inde i endosomes og smugles til lysosomer for nedbrydning og nyttelast frigive 8. Den intracellulære menneskehandel proces giver udfordringer for ACs opnår høje nyttelast specificitet og effekten mod målrette kræftceller. For eksempel, mange antigener såsom Her2 (mål for terapeutisk AC Trastuzumab-emtansine) kan genbruge op til 85% af bundne antistoffer i de første 30 min. 9. Desuden, når nedbrydning sker, frigivne kemoterapeutika og radioisotoper kan aktivt eksporteres af øget udtryk og/eller aktivitet af membran forbundet transport proteiner 10,11. Lysosomet nedbrydning også hindrer levering af nye biologiske nyttelast som terapeutisk enzymer og oligonukleotider, der kan være deaktiveret 12,13. I det væsentlige, er kræftcellen meget effektive på om ophævelse af den nødvendige intracellulære ophobning af nyttelast leveret af ACs.
Denne protokol beskriver, hvordan du implementerer begrebet ACs-koblet til virus-afledte peptider, specielt til undslippe endosome fastklemning og lokalisering til cellekernen. Med sådanne raffinement at manipulere værtssystemer celle, er det ikke overraskende, at udviklingen af virus-afledte proteiner og peptider som potentielle biopharmaceuticals længe har været indgroet i terapeutisk forskning 14. Angiv værtsceller for millioner af år virus har udviklet sig til at erhverve en enestående samling af proteiner kan udnytte normale fysiologiske pattedyr celle systemer til effektivt. For vira, som er internaliseret via receptor-medieret endocytose, er de også udfordret med flygter handel til lysosomet hvor stormløb af en lokaliseret koncentration af proteaser kan være problematisk for overlevelse. En vel karakteriseret viral-afledte peptid udnyttes i medicinafgivelse for undslippe endosome fastklemning er human immundefekt virus transaktivatoren transskription (Tat) protein 15. Tat er stand til at undslippe endosome fastklemning af sensing lav-pH på hvilket tidspunkt sker protein konformationelle ændringer aktivering Tat for at indsætte sig selv ind og forstyrre endosomal membran 16. Dette resulterer i Tat-nyttelast konjugater kan få adgang til cytoplasma. Den anden viral manipulation element, der vedrører denne protokol er den fremgangsmåde, der anvendes til at levere terapeutiske gener og narkotika til kernen 17. Virus har udviklet sig til at kunne manipulere vært celle maskiner til går forbi Kernemembranen ved at passere gennem den nukleare pore komplekse (NPC). Cellulære makromolekyler indeholder (eller binder sig til proteiner, der indeholder) nukleare lokalisering signaler (NLSs) nødvendige for bindende til nukleare transport proteiner (f.eks. karyopherins α og β), som giver de nødvendige bevægelser gennem NPC. Virus har udviklet proteiner til at indeholde NLS-sekvenser, der giver dem mulighed for at udnytte vært celle transport proteiner for shuttling i nucleus 18.
Talrige ACs har tidligere været functionalized med Tat - og NLS-afledte peptider og testet for deres evne til at ophobes inde i kræftcellerne og for målretning tumorer 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabel 1). Undersøgelser levere cytotoksiske nyttelast viste, at ACs modificeret med virus-afledte peptider er stand til at øge cellulære ophobning, cytotoksicitet og tumor dræbe over umodificeret ACs 22,26. Et fælles træk for denne roman klasse af AC er deres konstruktion. Typisk, peptider indeholde en terminal cystein giver en gratis sulfhydryl gruppe. MAbs er først reagerede med en noncleavable bifunctional crosslinker som indeholder N- hydroxysuccinimide (NHS) og maleimide grupper i modsatte ender. NHS estere reagere med primære aminer på mAb at danne akrylamid obligationer. Den monomers mAb med gratis maleimide grupper er derefter reagerede med sulfhydryl grupper på peptider til at danne et thioester bånd og dermed forbinder peptid og mAb. Selv om homobifunctional overfladebehandlingsvæsker har været brugt 28, heterobifunctional crosslinker er mere almindeligt anvendt i opbygningen af virus-afledte peptid-ACs 22,23,26, 31,32. Denne protokol bruger specifikt crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-carboxylat (sulfo-Investeringsfondene) for sin brugervenlighed og fordi det er brugt i den godkendte antistof-drug konjugat Trastuzumab-emtansine og i mange virus-afledte peptid-ACs 8,22,23,26,31,32. Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) er den primære metode for i første omgang konstatering konjugation effektivitet og semi-kvantificere antallet af peptider pr. mAb. Konfokal mikroskopi ved hjælp af en fluorescently mærket sekundær antistof specifikke til mAb er typisk metode til i første omgang evaluering af intracellulær distribution egenskaber af virus-afledte peptid-modificerede ACs. Hidtil er radioisotoper de primære nyttelast leveret af virus-afledte peptid-modificerede ACs. Radioisotoper er fordelagtig, fordi radioaktivitet i celler er nemt kvantificeres ved gamma optælling. Derudover ACs, der er oversat til musemodeller af menneskelige kræftformer giver forskere mulighed for at evaluere tumor målretning ved hjælp af molekylær billeddannelse modaliteter som single photon emission beregnet tomografi og positron emission tomografi (PET) 23 , 32 , 33. I almindelighed, konstruktion og validering af testmetoder primært bruges af forskere giver en meget god vurdering af ACs modificeret med virus-afledte peptider stadiet indledende udvikling effektivt at komme ind og levere den nyttelast inde målcellerne og target tumorer.
TAT og NLS-modificerede ACs har belyst nøgleområder til yderligere forbedring af nyttelasten levering inden kræftceller og tumorer. Med hensyn til NLS-modificerede ACs, kan effektivitet i intracellulære ophobning være beskedne 23,31,34. Ineffektiv intracellulære ophobning er forårsaget af fortsatte endosomal entrapment. In vivo tumor målretning kan også blive formindsket med begge Tat og NLS-modificerede ACs. De aktive sekvenser af Tat og NLS indeholder flere positive ladede rester. Når knyttet til mAbs, kan den samlede kationiske afgift være betydeligt øgede 35. Som en konsekvens har af Tat og NLS-modificerede ACs øget optagelse i sundt væv og øget hurtige blod clearance.
Vores gruppe udviklet et komposit stof bestående af cholic syre knyttet til NLS (ChAcNLS; Figur 1). ChAcNLS-ændret ACs er stand til at øge intracellulære ophobning af leverede radioisotoper og forbedre tumor målretning i forhold til NLS-modificerede og traditionelle ACs 33,34. Mekanismen bag cholic syre er inspireret af udvalgte nonenveloped virus, der ikke kan stole på membran fusion at udnytte cholic syre til at udløse endosome flugt gennem dannelsen af ceramid evne. For eksempel, rekrutter svin enteriske virus cholic syre, der aktiverer sphingomyelinase, som katalyserer hydrolyse af sphingomyelin i ceramid 36,37,38. Dette destabiliserer endosomal membran og giver mulighed for virus undslippe. Således er cholic syre en anden virus-afledte komponent, der supplerer NLS.
Da feltet bevæger sig fremad og fremtidige forekommer fremskridt i nyttelast levering af ACs modificeret med virus-afledte peptider, det er et belejligt tidspunkt at give visuelle demonstrationer af deres biokemiske og funktionelle egenskaber under indledende udvikling. Her beskriver vi vores protokol for den oprindelige vurdering af virus-afledte peptid-modificerede ACs for effektive og enkle bestemmelse af intracellulære ophobning og tumor målretning i den tidlige fase udvikling. Vi bruger det kommercielt tilgængelige mAbs 7 g 3 og A14 som eksempel modelsystemer. Procedure 1 beskriver brugen af SDS-PAGE som en metode, der giver mulighed for ' go/no go' beslutninger for beregnede ACs. Procedure 2 beskriver en metode ved hjælp af trypsinization giver mulighed for bedre visualisering af AC intracellulære distribution og akkumulering. Procedure 3 beskriver en metode til forbedret intracellulære fraktionering til præcist bestemme nukleare lokalisering. I denne procedure vi udnytte nyttelast 64Cu (t1/2 = 12,7 h) fordi det er sårbare over for cellulære efflux og en positron emitter 10. Således er beskriver proceduren 4 i vivo tumor målretning karakterisering af PET imaging for at visualisere tumor optagelse i forhold til baggrund (dvs. nontarget sunde væv) og afgøre, om eksemplet med AC kan konkret og effektivt Target tumorer. Disse metoder er tilstrækkelig for efterforskerne udvikle ACs modificeret med virus-afledte peptider til at identificere kandidater til videre avancement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22122</td>
			<td>There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td>There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375EDU</td>
			<td>Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 or 500 mL volumes to choose from.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>1-10 &#956;g/mL recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOTA-NHS</td>
			<td>CheMatech</td>
			<td>C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin A/C antibody (N-18)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A14 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TF-1a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIDE medical imaging software</td>
			<td>available at amide.sourceforge.net</td>
			<td></td>
			<td>Completely free download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView FV1000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>www.olympus-lifescience.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITLC strips</td>
			<td>Biodex</td>
			<td>150-771</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides for increasing cellular accumulation and improving tumor targeting

Antistof-konjugater (ACs) modificeret med virus-afledte peptider er en potentielt stærk klasse af tumor celle levering agenter for Molekylær nyttelast bruges i kræftbehandling og imaging på grund af øget cellulær ophobning over nuværende ACs. Under tidlig AC in vitro- er udvikling, fluorescens teknikker og radioimmunoassays tilstrækkelig for bestemmelse af intracellulære lokalisering, ophobning effektivitet og målet celle specificitet. I øjeblikket er der ikke enighed om standardiserede metoder for at forberede celler til evaluering af AC intracellulære ophobning og lokalisering. Den indledende testning af ACs modificeret med virus-afledte peptider er kritisk, især hvis flere kandidater har været konstrueret. Bestemmelse af intracellulære ophobning af fluorescens kan blive påvirket af baggrunden signal fra ACs på celleoverfladen og komplicere fortolkningen af ophobning. For radioimmunoassays, typisk behandlede celler er fraktioneret og radioaktivitet i forskellige celle rum målt. Men celle lysis varierer fra celle til celle og ofte nukleare og cytoplasmatisk rum er ikke tilstrækkeligt isoleret. Dette kan give vildledende oplysninger om nyttelast levering egenskaber. Intravenøs injektion af radiolabeled virus-afledte peptid-modificerede ACs i tumor forsynet med mus efterfulgt af radionuklid imaging er en kraftfuld metode til bestemmelse af tumor målretning og nyttelast levering egenskaber på i vivo fase af udvikling. Men dette er en forholdsvis ny fremgang og nogle grupper har evalueret virus-afledte peptid-modificerede ACs på denne måde. Vi beskriver behandlingen af behandlede celler mere præcist vurdere virus-afledte peptid-modificerede AC ophobning, når du bruger Konfokal mikroskopi og radioimmunoassays. Specifikt, bundet en metode til trypsinizing celler til at fjerne celleoverfladen ACs. Vi tilbyder også en metode til forbedring af cellulære fraktionering. Endelig giver denne protokol en i vivo metode ved hjælp af positron emissions tomografi (PET) for at vurdere oprindelige tumor målretning egenskaber i tumor-bærende mus. Vi bruger radioisotop 64Cu (t1/2 = 12,7 h) som et eksempel nyttelast i denne protokol.

For Procedure 1, opførelsen af 7 g 3 modificeret med ChAcNLS brug af sulfo-Investeringsfondene, som en crosslinker er meget pålidelig. Typisk, når læsset på en 12% gel og analyseret af SDS-PAGE, dette resulterer i en identificerbar trinvis stigning i MW proportionalt med stigende sulfo-Investeringsfondene-til - 7 g 3 nøgletal bruges og giver mulighed for de tunge og lette kæder vurderes individuelt for ChAcNLS konjugering (figur 3). 7G 3 reagerede på 10-, 20-, 25-...

Watch this Scientific Journal Video about Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting at JoVE.com

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Viral-afledte peptider koblet til antistof-konjugater (ACs) er en tilgang vinder momentum på grund af potentialet for at levere molekylære nyttelast med øget tumor celle ophobning. Ved hjælp af fælles metoder til at vurdere peptid konjugering, AC og nyttelast intracellulære ophobning og tumor målretning, hjælper denne protokol forskere i de vigtige indledende udviklingsfaser.

Indledende vurdering af antistof-konjugater modificeret med Viral-afledte peptider til at øge cellulære ophobning og forbedring af Tumor målretning

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Produktion og Målretning af Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fremstilling af en funktionaliseret Magnetic Bakteriel Nanocellulose med Iron Oxide Nanopartikler

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Celle Mærkning og målretning med Superparamagnetisk jernoxid Nanopartikler

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidnanopartikler (SLNs) til intracellulær målretning Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Fabrikation af en multiplex kunstige cellulære mikromiljø Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

Syntese af Multi-bjergomgivne kulstofnanorør modificeret med sølv nanopartikler og evaluering af deres antibakterielle aktiviteter og cytotoksiske egenskaber

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...