Name: initial evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides for increasing cellular accumulation and improving tumor targeting
Uploaded: 2018-03-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de kanker Research Society (Canada) en de CIMS. De auteurs bedanken Dr. Samia Ait-Mohand en Jean-Francois Beaudoin voor hulp. Dr. Angel Lopez (Universiteit van Zuid-Australië) voor mAb A14.

De in vivo dierproeven beschreven werden uitgevoerd volgens een goedgekeurde protocol en onder de ethische richtsnoeren van de ethische commissie van Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke voor dier experimenten.
1. antilichaam Peptide Woordherkomst en-opbouw
Opmerking: ChAcNLS kan gesynthetiseerd worden bij elke commerciële peptide fabrikant of universiteit-aangesloten peptide synthese serviceplatform. De synthese van ChAcNLS kan worden gevonden in ...

Belangrijkste doelstellingen van systemische levering van anti-kanker agenten zijn te verhogen van accumulatie op de site van de tumor, en opname binnen kankercellen, of ongewenste bijwerkingen in de gezonde weefsels. AC gericht levering van moleculaire payloads aan tumorcellen is een zeer veelbelovende benadering behandelen en tumoren op te sporen. Echter het gebrek aan doeltreffendheid veroorzaakt door beklemming van de endosome en beneden lysosomale aantasting van de stream blijft een belangrijke uitdaging. Terwijl di...

Antilichaam-geconjugeerde (ACs) zijn biofarmaceutica die zijn rijpen in een transformatieve klasse effectieve geneesmiddelen voor de verbetering van behandelingen van kanker en voor het opsporen van tumoren. Samengesteld uit een monoklonaal antilichaam (mAb) geconjugeerd met moleculaire payloads zoals radio-isotopen, kleine moleculen en biologische toxines, ACs kunnen leveren deze codering van de payloads tot kankercellen met uitgelezen doelwit antigeen affiniteit en specificiteit. Dus ACs hebben het potentieel om aanzienlijk verminderen van niet-specifieke toxiciteit en lading activiteit op de site van de tumor te verhogen. Therapeutisch, zijn ACs vervoer van cytotoxische kleine moleculen (meestal genoemd antilichaam-drug conjugaten) goedgekeurd voor de behandeling van patiënten met borstkanker en Hodgkin lymfoom die hebben gefaald conventionele behandelingen 1, 2. Daarnaast ACs vervoeren radioactieve isotopen (kortweg radioimmunoconjugaten) zijn ook in ontwikkeling. Een AC vervoeren een isotoop voor imaging is goedgekeurd voor het identificeren van prostaatkanker uitzaaiing 3. Met veel meer therapeutische ACs ingediend voor goedkeuring 4, is optimisme voor de toekomst van de ACs om kanker zorg 5hoog.
Echter bij het afleveren van chemotherapeutica of radio-isotopen, ACs ondervindt bij het effectief accumuleren deze codering van de payloads binnen doelcellen. Dit aspect aanzienlijk bijdraagt in veel gevallen in het onvermogen van de ACs om langdurige ziektevrije overleving of hoog contrast tumor imaging 6,7. In het algemeen, zodra ACs binden hun doel-antigeen zijn ze geïnternaliseerd via een proces dat bekend staat als receptor-gemedieerde endocytose. De ACs zijn vervolgens binnen de Endosomen in de val gelokt en verhandeld aan lysosomen voor afbraak en payload vrijgeven 8. Het intracellulaire mensenhandel proces vormt uitdagingen voor ACs aan het bereiken van een hoog laadvermogen specificiteit en werkzaamheid tegen kanker van de doelcellen. Bijvoorbeeld, veel antigenen zoals Her2 (doel voor therapeutische AC Trastuzumab-emtansine) tot 85% van de gebonden antilichamen in de eerste 30 min 9kunt recyclen. Bovendien, zodra aantasting optreedt, vrijgegeven chemotherapeutica en radio-isotopen kunnen worden actief geëxporteerd door de verhoogde expressie en/of activiteit van membraan geassocieerde vervoer eiwitten 10,11. Lysosoom afbraak belemmert ook de levering van nieuwe biologische payloads zoals therapeutische enzymen en oligonucleotides die kunnen worden gedeactiveerd, 12,,13. Kortom, is de kankercel zeer effectief bij intrekking van de nodige intracellulaire accumulatie van nettoladingen geleverd door ACs.
Dit protocol beschrijft hoe de uitvoering van het concept van het ACs-gekoppeld aan virus afkomstige peptides, speciaal voor endosome entrapment ontsnappen en lokaliseren naar de celkern. Met dergelijke verfijning te manipuleren cel hostsystemen, is het niet verwonderlijk dat de ontwikkeling van het virus afkomstige eiwitten en peptiden als potentiële biofarmaceutica lang heeft zijn ingebakken in therapeutisch onderzoek 14. Voor miljoenen jaren zijn virussen geëvolueerd om te verwerven van een uitzonderlijke collectie van eiwitten kunnen profiteren van normale fysiologische zoogdieren cel systemen om effectief gastheer cellen. Voor virussen die zijn geïnternaliseerd via receptor gemedieerde endocytose, zijn ze ook uitgedaagd met ontsnappen aan het lysosoom handel waar de aanval van een gelokaliseerde concentratie van proteasen kan problematisch zijn voor overleving. Een goed gekarakteriseerd virale afkomstige peptide gebruikt in drug levering voor het ontsnappen van endosome entrapment is het humaan immunodeficiëntie virus transactivator van transcriptie (Tat) eiwit 15. Tat vermag endosome entrapment ontsnappen door het aftasten van lage-pH op welk punt eiwit conformationele wijzigingen optreden waardoor Tat als u wilt invoegen zich in en verstoren de membraan endosomal 16. Dit resulteert in Tat-nettolading geconjugeerde kundig voor vlaag van het cytoplasma. Het tweede element van de virale manipulatie gerelateerde bij dit protocol is de aanpak gebruikt voor therapeutische genen en drugs naar de kern 17. Virussen zijn geëvolueerd om te manipuleren met succes host cel machines voor vordert langs het kernmembraan door door de nucleaire porie complexe (NPC). Cellulaire macromoleculen bevatten (of binding aan eiwitten die bevatten) nucleaire localisatie signalen (NLSs) nodig voor bindende tot nucleaire transport eiwitten (bv karyopherins α en β), waarmee de vereiste bewegingen door de NPC. Virussen hebben eiwitten bevatten NLS-sequenties die hen voorzien van de mogelijkheid om gebruik te maken van host cel vervoer eiwitten voor pendelen in de nucleus 18ontwikkeld.
Talrijke ACs eerder matiemaatschappij met Tat - en NLS-afgeleide peptiden en getest voor hun vermogen om te accumuleren binnen kankercellen en voor het targeten van tumoren 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabel 1). Studies leveren van cytotoxische payloads hebben aangetoond dat ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden kunnen aanzienlijk verhoging van cellulaire accumulatie, cytotoxiciteit en tumor doden over ongewijzigde ACs 22,26. Een gemeenschappelijk kenmerk voor deze nieuwe klasse van het Keuzeaxioma is hun bouw. Doorgaans bevatten peptiden een terminal cysteïne bieden een gratis sulfaatzuurstof groep. MAbs zijn eerste reageerde met een noncleavable bifunctionele crosslinker met N- hydroxysuccinimide (NHS) en maleimide groepen op tegenovergestelde uiteinden. De NHS esters reageren met primaire amines op de mAb aan amide-bindingen. De gereageerde mAb met gratis maleimide groepen is het vervolgens reageerde met de sulfaatzuurstof groepen op de peptiden te vormen van een thio-ester-binding en dus het koppelen van de peptide en mAb. Hoewel homobifunctional crosslinkers geweest gebruikte 28, heterobifunctional crosslinker meer in het algemeen worden gebruikt in de bouw van virus-afgeleide peptide-ACs 22,23,26, 31,-32. Dit protocol gebruikt met name de crosslinker-sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC) voor zijn gebruiksgemak en omdat het wordt gebruikt in de goedgekeurde antilichaam-drug geconjugeerde Trastuzumab-emtansine en in veel virus-afgeleide peptide-ACs 8,22,23,26,31,32. Polyacrylamide-gelelektroforese (SDS-pagina) voor natrium dodecyl sulfaat is de primaire methode voor het aanvankelijk bepaling vervoeging rendement en semi-quantifying hetaantal peptiden per mAb. Confocale microscopie met behulp van een fluorescently-gelabeld secundair antilichaam specifiek voor de mAb is meestal de methode voor het aanvankelijk uitrekenen intracellulaire distributie eigenschappen van peptide gemodificeerde ACs virus-afgeleide. Tot nu toe zijn de radio-isotopen de primaire payloads geleverd door virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs. Radio-isotopen zijn voordelig omdat radioactiviteit in cellen wordt gemakkelijk gekwantificeerd door gamma tellen. Daarnaast ACs die zijn vertaald in muismodellen van menselijke kanker onderzoekers voorzien de mogelijkheid om de tumor gericht op met behulp van moleculaire beeldvorming modaliteiten zoals single photon emission berekende tomografie en positron emissie tomografie (PET) 23 , 32 , 33. In het algemeen, de constructie en validatie testmethoden voornamelijk gebruikt door onderzoekers bieden een zeer goede beoordeling van ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden tijdens het aanvankelijke ontwikkelingsstadium effectief invoeren en leveren de lading binnen doelcellen en voor doel tumoren.
Tat - en NLS-gemodificeerde ACs hebben verlichte sleutelgebieden voor verdere verbetering van de nettolading levering binnen cellen van kanker en tumoren. Met betrekking tot de NLS gemodificeerde ACs kunnen de efficiëntie van intracellulaire accumulatie bescheiden 23,31,34. Inefficiënte intracellulaire accumulatie wordt veroorzaakt door voortdurende endosomal entrapment. In vivo tumor targeting kan ook worden verminderd met beide Tat en NLS-gemodificeerde ACs. De actieve sequenties van Tat en NLS bevatten verschillende positief geladen residuen. Wanneer gekoppeld aan mAbs, kunnen de algemene kationische last aanzienlijk verhoogde 35. Dientengevolge hebben de Tat - en NLS-gemodificeerde ACs verhoogd van opname in de gezonde weefsels en snelle bloed klaring verhoogd.
Onze fractie ontwikkeld een samengestelde stof bestaande uit cholzuur en gekoppeld aan NLS (ChAcNLS; Figuur 1). ChAcNLS gemodificeerde ACs kunnen verhogen van intracellulaire accumulatie van radio-isotopen geleverde en tumor gericht op t.o.v. NLS gemodificeerde en traditionele ACs 33,34te verbeteren. Het mechanisme is erachter cholzuur en is geïnspireerd door de mogelijkheid van select nonenveloped virussen die niet op membraan fusion vertrouwen gebruiken cholzuur en om te activeren endosome ontsnappen door de vorming van ceramide. Varkens darmen virus werft bijvoorbeeld cholzuur en dat activeert sphingomyelinase, die de hydrolyse van sphingomyelinase in ceramide 36,37,38katalyseert. Dit endosomal membraan destabiliseert en zorgt voor virus ontsnappen. Cholzuur en is dus een ander virus afkomstige onderdeel dat perfect past bij NLS.
Als dit veld beweegt naar voren en toekomstige optreden vooruitgang in lading levering per ACs bewerkt met virus afkomstige peptides, is het een geschikt moment om visuele demonstraties van hun biochemische en functionele kenmerken tijdens de initiële ontwikkeling. Hier beschrijven we onze protocol voor de initiële beoordeling van virus-afgeleide peptide gemodificeerde ACs voor de efficiënte maar eenvoudige bepaling van intracellulaire accumulatie en tumor gericht op tijdens de vroege fase ontwikkeling. Als modelsystemen voorbeeld gebruiken we de verkrijgbare mAbs 7G 3 en de A14. Procedure 1 beschrijft het gebruik van SDS-pagina als een methode die het mogelijk voor besluiten van de ' go/no go' voor gebouwd ACs maakt. Procedure 2 beschrijft een methode met behulp van trypsinebehandeling waardoor verbeterde visualisatie van AC intracellulaire verspreiding en accumulatie. Procedure 3 beschrijft een methode voor verbeterde intracellulaire fractionering nauwkeurig bepalen nucleaire localisatie. In deze procedure we gebruik maken van de nettolading 64Cu (t-1/2 = 12,7 h) want het is kwetsbaar voor cellulaire efflux en een positron emitter 10is. Dus, de Procedure 4 beschrijft in vivo tumor gericht op karakterisering door PET imaging te visualiseren van opname van de tumor ten opzichte van de achtergrond (dat wil zeggen nontarget gezonde weefsels) en te bepalen of het voorbeeld AC kan specifiek en effectief doel de tumoren. Deze methoden zijn voldoende voor onderzoekers ontwikkelen ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden te identificeren van kandidaten voor verdere vooruitgang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22122</td>
			<td>There are many homo- and hetero-bifunctional maleimide crosslinkers to choose from.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC505096</td>
			<td>There are pack sizes of 8, 24, and 96. Choose according to your needs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610375EDU</td>
			<td>Mulicolor recombinant proteins from 10-250 kDa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>100 or 500 mL volumes to choose from.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A-21235</td>
			<td>1-10 &#956;g/mL recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOTA-NHS</td>
			<td>CheMatech</td>
			<td>C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamin A/C antibody (N-18)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-6215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab7 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-376362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A14 mAb</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TF-1a cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 30-2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMIDE medical imaging software</td>
			<td>available at amide.sourceforge.net</td>
			<td></td>
			<td>Completely free download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoView FV1000 Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>www.olympus-lifescience.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITLC strips</td>
			<td>Biodex</td>
			<td>150-771</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

initial evaluation of antibody-conjugates modified with viral-derived peptides for increasing cellular accumulation and improving tumor targeting

Antilichaam-geconjugeerde (ACs) bewerkt met virus afkomstige peptiden zijn een potentieel krachtig klasse van tumor cel levering agenten voor moleculaire laadvermogens gebruikt in de behandeling van kanker en imaging als gevolg van verhoogde cellulaire accumulatie over huidige ACs. Tijdens de vroege AC in vitro zijn ontwikkeling, fluorescentie technieken en radioimmunoanalyses voldoende voor het bepalen van de intracellulaire lokalisatie, accumulatie efficiëntie en target cel specificiteit. Op dit moment is er geen consensus over gestandaardiseerde methoden voor het voorbereiden van cellen voor de evaluatie van AC intracellulaire accumulatie en lokalisatie. De eerste testen van ACs bewerkt met virus afkomstige peptiden is essentieel vooral als er meerdere kandidaten zijn aangelegd. Bepalen van intracellulaire accumulatie door fluorescentie kan worden beïnvloed door het signaal van de achtergrond van de ACs aan het celoppervlak en bemoeilijken de interpretatie van accumulatie. Voor radioimmunoanalyses, meestal behandelde cellen zijn gespreide en de radioactiviteit in verschillende cel compartimenten gemeten. Echter lysis van de cel varieert van cel naar cel en vaak nucleaire en cytoplasmatische compartimenten zijn niet afdoende geïsoleerd. Deze kan misleidende gegevens over de eigenschappen van de levering van de lading produceren. De intraveneuze injectie van radiolabeled virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs in tumor rekening houdend met muizen gevolgd door radionuclide imaging is een krachtige methode voor het bepalen van de tumor gericht en lading levering eigenschappen in de in-vivo -fase van ontwikkeling. Echter dit is een relatief recente vooruitgang en enkele groepen virus afkomstige peptide gemodificeerde ACs op deze manier hebben geëvalueerd. We beschrijven de verwerking van behandelde cellen om nauwkeuriger virus afkomstige peptide gemodificeerde AC accumulatie bij het gebruik van de confocal microscopie en radioimmunoanalyses. Specifiek, een methode voor trypsinizing cellen verwijderen celoppervlak gebonden ACs. We bieden ook een methode voor het verbeteren van de cellulaire fractionering. Ten slotte, dit protocol voorziet een in vivo -methode met behulp van positron emissie tomografie (PET) evaluatie van de eerste tumor gericht op onroerend goed in tumor-dragende muizen. We gebruiken de isotoop 64Cu (t-1/2 = 12,7 h) als de payload van een voorbeeld in dit protocol.

Voor Procedure 1, de constructie van 7G 3 bewerkt met ChAcNLS gebruik van sulfo-SMCC als een crosslinker zeer betrouwbaar is. Meestal, wanneer geladen op een 12% gel en geanalyseerd door SDS-PAGE, dit resulteert in een te onderscheiden stapsgewijze verhoging MW evenredig met verhoging van sulfo-SMCC-tot - 7G 3 ratio's gebruikt en zorgt voor de zware en lichte kettingen worden individueel beoordeeld voor ChAcNLS vervoeging (Figuur 3). 7G 3 reageerde op 10-, 20 - 25- en 50-...

Watch this Scientific Journal Video about Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting at JoVE.com

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Viral afkomstige peptiden gekoppeld aan antilichaam-geconjugeerde (ACs) is een aanpak die wint dynamiek als gevolg van het potentieel van het leveren van moleculaire payloads met verhoogde tumor cel accumulatie. Gebruik makend van gemeenschappelijke methoden voor evaluatie van peptide conjugatie, AC en lading intracellulaire accumulatie en tumor gericht op, helpt dit protocol onderzoekers tijdens de cruciale eerste ontwikkelingsfasen.

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Increasing cDNA Yields from Single-cell Quantities of mRNA in Standard Laboratory Reverse Transcriptase Reactions using Acoustic Microstreaming

Het verhogen van cDNA Opbrengsten van Single-cell hoeveelheden mRNA in standaard laboratorium reverse transcriptaseremmers Reacties met behulp van Acoustic Microstreaming

Correlating gene expression with cell behavior is ideally done at the single-cell level.  However, this is not easily achieved because the small amount of ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Hydrofobe Salt gemodificeerde Nafion voor enzym immobilisatie en stabilisatie

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

Productie en Targeting van Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Cel Labeling en Targeting met superparamagnetische ijzeroxide Nanodeeltjes

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

Synthese van Meerwandige koolstof nanobuisjes bewerkt met zilveren nanodeeltjes en evaluatie van hun antibacteriële activiteiten en cytotoxische eigenschappen

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...