Name: a rapid automated protocol for muscle fiber population analysis in rat muscle cross sections using myosin heavy chain immunohistochemistry
Uploaded: 2017-03-28T13:00:00
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Diese Studie wurde von der Christian Doppler Forschungsgemeinschaft unterstützt. Wir möchten, dass Sabine Rauscher von der Core Facility Imaging an der Medizinischen Universität Wien, Österreich für die Unterstützung während des gesamten Projektes danken. Primäre Antikörper wurden von Schiaffino, S. entwickelt, erhalten von der Entwicklungs Studies Hybridoma Bank durch die NICHD des NIH erstellt und an der University of Iowa, Fachbereich Biologie, Iowa City, IA gehalten.

Alle Verfahren einschließlich Tierversuchspersonen wurden in Übereinstimmung mit den Prinzipien der Labortierhaltung durchgeführt , wie von FELASA 26 empfohlen. Genehmigung erhalten wurde vor der Studie der Institutional Review Board der Medizinischen Universität Wien und das Bundesministeriums für Forschung und Wissenschaft (BMWF: Bund fuer Wissenschaft und Forschung, Referenznummer: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014). 1. Muskel-Ernte HINWEIS: Eine fr...

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+muscle+fiber+type+population+analysis+with+ImageJ+of+whole+rat+muscles+using+rapid+myosin+heavy+chain+immunohistochemistry.">Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry.</a> Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+guidelines+and+recommendations.">FELASA guidelines and recommendations.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. 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<html> Hier zeigen wir eine allgemein zugängliche Methodik zu studieren und automatisch die Muskelfaser Populationen von Ratten Querschnitt über die Immunhistochemie in einer Zeit effiziente Art und Weise zu quantifizieren. Für Reproduzierbarkeit präsentieren wir einen detaillierten Schritt für Schritt erklärt und mögliche Modifikationen für Anwendungen in anderen Arten, die nicht in dieser Studie beschrieben. Darüber hinaus diskutieren wir die Vorteile des Verfahrens, Voraussetzungen für eine optimale Funktion...

Skelettmuskelmasse erfährt tiefe Veränderungen während der physiologischen Prozesse , wie Alter 1, 2, Aufgabe 3, 4, 5, 6, 7 oder pathophysiologische Prozesse wie Krankheit 8, 9, 10 oder 11 Trauma. mehrere Forschungsfelder konzentrieren sich auf die strukturellen Auswirkungen dieser Prozesse daher zu funktionellen Veränderungen zu verstehen. Einer der wichtigsten Aspekte der Muskelfunktion bestimmt, ist die Zusammensetzung der Muskelfasern. Muskelfasern exprimieren verschiedene Myosin schwere Kette (MHC) -Proteinen und dadurch klassifiziert in langsam, mittel oder schnell Fasern 7, 12, 13 </sup<html> &gt;, 14, 15, 16, 17. Physiologisch haben Muskeln unterschiedliche Muskelfaserzusammensetzungen in Abhängigkeit von ihrer Funktion im Körper. Verwendung von Muskelfasern Typisierung, Faserpopulationen kann quantifiziert werden 7 Anpassung an physiologische oder pathophysiologische Prozesse zu identifizieren, 17. Historisch gesehen, wurde zwischen den Muskelfasertypen zu unterscheiden, eine Anzahl von zeitraubenden Methoden angewandt. Zu diesem Zweck wurde Muskelfasern entweder bei verschiedenen pH-Werten oder Muskelenzymaktivität durch die Reaktivität von Myosin ATPase eingestuft. Da unterschiedliche Faserqualitäten nicht in einem einzigen Abschnitt, mehrere Querschnitte erforderlich waren , bewertet werden könnten alle Muskelfasern zu identifizieren und 14 manuelle Quantifizierung ermöglichen, 16, 17,= &quot;Xref&quot;&gt; 18, 19, 20, 21, 22. Im Gegensatz dazu verwendeten jüngste Veröffentlichungen Immunhistochemie (IHC) gegen Myosin schweren Kette-Protein kodiert, um schnell mehrere Fasertypen in einer einzelnen Querschnitte beflecken. Auf der Grundlage der Vorteile dieses Verfahrens ist es nun der Goldstandard in der Muskelfaserpopulationsanalyse betrachtet 19, 23, 24. Mit verbesserten IHC Färbeprotokollen, waren wir, dass die vollautomatische Erfassung ganzer Muskelquerschnitt und die anschließenden Faser Quantifizierung automatischer Muskels zu zeigen, vor kurzem der Lage möglich ist, die Open-Source-Plattform ImageJ. Im Vergleich zu manueller Quantifizierung, vorausgesetzt unser Verfahren eine signifikante Abnahme in der Zeit (etwa 10% der manuellen Analysen) erforderlich pro Folie während genauer wobei 4% bis ± 25 </sup&gt;. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine schnelle, zuverlässige, benutzerunabhängige Anleitung zur automatischen Muskelfaser Quantifizierung in ganzen Ratten Muskeln unter Verwendung einer Open-Source-Plattform zu beschreiben. Darüber hinaus beschreiben wir mögliche Änderungen, die seine Verwendung für andere Proben wie Mäuse oder menschliche Muskeln erlauben würden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">O.C.T compound</td>
			<td style="width:397px;">Tissue-Tek, Sakura, Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For embedding of muscle tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopentane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for adequate freezing of muscle tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Ultra Plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td align="right">1014356190</td>
			<td>adhesive slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td align="right">85112</td>
			<td>Detergent Soluation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>50197Z</td>
			<td>Goat Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAKO Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako pen</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TissueFAXSi plus&#160;</td>
			<td>TissueGnostics, Vienna, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa&#160;Fluor&#160;633&#160;Goat Anti-Mouse IgG2b&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>A-21146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1&#160;(&#947;1)</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (&#181; chain),</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>A-21426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid automated protocol for muscle fiber population analysis in rat muscle cross sections using myosin heavy chain immunohistochemistry

Quantifizierung von Muskelfaserpopulationen stellt einen tieferen Einblick in die Auswirkungen der Krankheit, Trauma und verschiedene andere Einflüsse auf die Skelettmuskelmasse. Verschiedene zeitaufwendige Verfahren sind traditionell verwendet worden, Faserpopulationen in vielen Bereichen der Forschung zu studieren. Doch vor kurzem immunhistochemischen Methoden basierend auf Myosin Proteinexpression bietet eine schnelle Alternative entwickelt, um mehrere Fasertypen in einem einzigen Abschnitt zu identifizieren. Hier präsentieren wir ein schnelles, zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll für eine verbesserte Qualität der Färbung, so dass die automatische Erfassung ganzer Querschnitt und die automatischen Quantifizierung von Faserpopulationen mit ImageJ. Zu diesem Zweck werden eingebettete Skelettmuskulatur in Querschnitte geschnitten, gefärbt unter Verwendung von schweren Myosinketten der Antikörper mit fluoreszierenden sekundären Antikörper und DAPI für Zellkerne Färbung. Ganze Querschnitte werden dann hochauflösendes Verbund automatisch über einen Schiebe Scanner gescannt zu erhaltenBilder der gesamten Probe. Faserpopulation Analysen werden anschließend langsam, mittel und schnell Fasern unter Verwendung eines automatisierten Makro für ImageJ ausgeführt zu quantifizieren. Wir haben zuvor gezeigt, dass diese Methode Populationen Faser identifizieren kann zuverlässig auf ein Maß von ± 4%. Darüber hinaus reduziert diese Methode inter Benutzer Variabilität und Zeit pro signifikant die Open-Source-Plattform ImageJ Analysen mit.

Ganzer Rattenmuskel Querschnitt wurden gefärbt schnell Immunhistochemie unter Verwendung von MHC-I, IIA und IIB Muskelfasern zu identifizieren. Unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops Diascanners wurden ganze Querschnitte dann für automatisierte Muskelfasern automatisch erfasst Analysen mit ImageJ. Das Konzept des Verfahrens zugrunde, eine einfache, zuverlässige und zeitsparende Workflow für die Quantifizierung von Muskelfasern auf der Bereitstellung. <p class="jove_content...

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A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Hier präsentieren wir ein Protokoll für schnelle Muskelfaseranalysen, die eine verbesserte Färbequalität ermöglicht und dadurch die automatische Erfassung und Quantifizierung von Faserpopulationen die frei verfügbare Software ImageJ.

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Forschung

Biologie

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generierung von Myospheres Von hESCs durch epigenetische Reprogrammierung

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Sequenzielle Immunfluoreszenz und Immunhistochemie an kryosektionierten Zebrafisch-Embryonen

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

A Simple and Inexpensive Running Wheel Model for Progressive Resistance Training in Mice

Ein einfaches und kostengünstiges Laufradmodell für progressives Widerstandstraining bei Mäusen

Previously developed rodent resistance-based exercise models, including synergistic ablation, electrical stimulation, weighted-ladder climbing, and most ...

Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration via Decellularization

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration (Video) | JoVE 

Dezellularisierungsbasierte Quantifizierung der Fettinfiltration der Skelettmuskulatur

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic ...

Confocal Microscopic Analysis of Rat Muscle Mitochondria

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

Mitochondrial Remodeling in Skeletal Muscle (Video) | JoVE

Analyse der mitochondrialen Dichte und Längsverteilung in lebenden Skelettmuskelfasern von Ratten mittels konfokaler Mikroskopie

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...