Name: a rapid automated protocol for muscle fiber population analysis in rat muscle cross sections using myosin heavy chain immunohistochemistry
Uploaded: 2017-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dalla Fondazione Christian Doppler Research. Vorremmo ringraziare Sabine Rauscher dal Nucleo strumento Imaging presso l&#39;Università di Medicina di Vienna, Austria per il supporto durante tutto il progetto. Gli anticorpi primari sono stati sviluppati da Schiaffino, S., ottenuto dal Developmental Studies Ibridoma Bank, creata dal NICHD del NIH e mantenuta a L&#39;University of Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA.

Tutte le procedure tra soggetti animali sono state condotte nel rispetto dei principi di cura degli animali da laboratorio, come raccomandato dal FELASA 26. Soddisfazione è stata ottenuta prima dello studio da parte del comitato di revisione istituzionale della Medical University di Vienna e dal Ministero austriaco per la ricerca e la scienza (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, numero di riferimento: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014). 1. muscolare Harvest <p...

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+muscle+fiber+type+population+analysis+with+ImageJ+of+whole+rat+muscles+using+rapid+myosin+heavy+chain+immunohistochemistry.">Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry.</a> Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).</li><li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+guidelines+and+recommendations.">FELASA guidelines and recommendations.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li><li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease.">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. 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<html> Qui, dimostriamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare e quantificare le popolazioni di fibre muscolari di sezioni trasversali di ratto mediante immunoistochimica in modo efficiente tempo automaticamente. Per la riproducibilità, presentiamo un passo dettagliate descrizione passo e potenziali modifiche per applicazioni in altre specie non descritte in questo studio. Inoltre, si discute i vantaggi del procedimento, prerequisiti per la funzione ottimale e suoi limiti. Attua...

Composizione muscolo scheletrico subisce profonde modificazioni durante i processi fisiologici quali l&#39;invecchiamento 1, 2, 3 esercizio, 4, 5, 6, 7, o processi patofisiologici come il morbo 8, 9, 10 o 11 trauma. Quindi, diversi campi di concentrato di ricerca sugli effetti strutturali di questi processi per capire i cambiamenti funzionali. Uno degli aspetti chiave che determinano la funzione muscolare è la composizione delle fibre muscolari. Fibre muscolari esprimono catena pesante proteine differente miosina (MHC) e sono quindi classificate in lento, intermedi, o veloce fibre 7, 12, 13 </sup<html> &gt;, 14, 15, 16, 17. Fisiologicamente, muscoli hanno differenti composizioni di fibre muscolari a seconda della loro funzione nel corpo. Utilizzando fibre muscolari digitazione, le popolazioni di fibre possono essere quantificati per identificare adattamento a processi fisiologici o patofisiologici 7, 17. Storicamente, sono stati applicati vari metodi richiedono tempo per distinguere tra tipi di fibra muscolare. A questo scopo, le fibre muscolari erano classificati mediante reattività della miosina ATPasi a diversi livelli di pH o enzima attività muscolare. Come differente qualità di fibra non può essere stabilita in una singola sezione, sezioni multiple sono stati richiesti per identificare tutte le fibre muscolari e permettere manuale quantificazione 14, 16, 17,= &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20, 21, 22. Al contrario, recenti pubblicazioni usati immunoistochimica (IHC) contro proteina miosina catena pesante di macchiare rapidamente tipi di fibre multiple in un singolo sezioni trasversali. Sulla base dei vantaggi di questa procedura, è ora considerato il gold standard per l&#39;analisi della popolazione fibre muscolari 19, 23, 24. Utilizzando migliorate protocolli di colorazione IHC, recentemente siamo stati in grado di dimostrare che l&#39;acquisizione completamente automatica delle sezioni trasversali muscolo intero e successiva quantificazione automatica fibra muscolare è possibile utilizzando la piattaforma open source ImageJ. Rispetto alla quantificazione manuale, la nostra procedura prevista una significativa diminuzione del tempo (circa il 10% di manuale analisi) richiesto per vetrino pur essendo precisione di ± 4% 25 </sup&gt;. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di descrivere una guida rapida, affidabile, facile da indipendente quantificazione automatica fibra muscolare nei muscoli interi di ratto utilizzando una piattaforma open source. Inoltre, si descrivono i potenziali modifiche che avrebbero permesso il suo utilizzo per altri campioni, come topi o muscoli umani.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">O.C.T compound</td>
			<td style="width:397px;">Tissue-Tek, Sakura, Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For embedding of muscle tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopentane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for adequate freezing of muscle tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Ultra Plus slides</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td align="right">1014356190</td>
			<td>adhesive slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td align="right">85112</td>
			<td>Detergent Soluation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>50197Z</td>
			<td>Goat Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAKO Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dako pen</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TissueFAXSi plus&#160;</td>
			<td>TissueGnostics, Vienna, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa&#160;Fluor&#160;633&#160;Goat Anti-Mouse IgG2b&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>A-21146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1&#160;(&#947;1)</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>A-21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (&#181; chain),</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>A-21426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific, Germany</td>
			<td>R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid automated protocol for muscle fiber population analysis in rat muscle cross sections using myosin heavy chain immunohistochemistry

La quantificazione delle popolazioni di fibra muscolare fornisce una più profonda comprensione degli effetti di malattie, traumi, e varie altre influenze sulla composizione del muscolo scheletrico. Vari metodi in termini di tempo sono stati tradizionalmente usati per studiare le popolazioni di fibra in molti campi della ricerca. Tuttavia, recentemente sviluppato metodi immunoistochimici basati su proteine ​​espressione della catena pesante della miosina fornire una rapida alternativa per identificare i tipi di fibre multiple in una singola sezione. Qui, vi presentiamo un protocollo rapido, affidabile e riproducibile per migliorare la qualità della colorazione, consentendo l&#39;acquisizione automatica di profilati trasversali interi e quantificazione automatica delle popolazioni fibra con ImageJ. A questo scopo, i muscoli scheletrici incorporati sono tagliati in sezioni, colorati con miosina catene pesanti anticorpi con anticorpi fluorescenti secondarie e DAPI per nuclei delle cellule colorazione. intere sezioni trasversali vengono esaminati automaticamente utilizzando uno scanner diapositiva per ottenere alta risoluzione compositole fotografie dell&#39;intera campione. analisi demografiche fibra vengono successivamente eseguite per quantificare fibre lente, intermedie e rapide utilizzando una macro automatizzato per ImageJ. Abbiamo precedentemente dimostrato che questo metodo può identificare popolazioni di fibre in modo affidabile ad un grado di ± 4%. Inoltre, questo metodo riduce la variabilità inter-utente e tempo per analisi significativamente utilizzando la piattaforma open source ImageJ.

Intero ratto muscolari sezioni sono state colorate rapidamente utilizzando l&#39;immunoistochimica per identificare MHC I, IIA e IIB fibre muscolari. Utilizzando uno scanner vetrino da microscopio a fluorescenza, intere sezioni sono state poi acquisiti automaticamente per fibra muscolare automatizzata analisi con ImageJ. Il concetto del procedimento si basa sulla fornitura di un flusso di lavoro semplice, affidabile e in tempi rapidi per la quantificazione delle fibre muscolari. <p c...

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A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Qui, presentiamo un protocollo per fibra muscolare rapida analisi, che permette di aumentare la qualità della colorazione, e quindi l&#39;acquisizione automatica e la quantificazione delle popolazioni fibre utilizzando il software ImageJ liberamente disponibile.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

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Mitochondrial Remodeling in Skeletal Muscle (Video) | JoVE

Analisi della densità mitocondriale e della distribuzione longitudinale nelle fibre muscolari scheletriche vive di ratto mediante microscopia confocale

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...