Name: assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture
Uploaded: 2017-05-10T14:00:00
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이 연구는 절강 성 자연 과학 재단 (LY15H310007), 절강 성 비영리 기술 응용 연구 프로젝트 (2016C37110), 중국 국립 자연 과학 재단 (U1503223, 81673407), 닝보 국제 과학 기술 협력 프로젝트 (2014D10019), 닝보시 생명 과학 및 건강 혁신 팀 (2015C110026), 과학 기술 광동성 국제 협력 프로젝트 (2013B051000038), 심천 기본 연구 프로그램 (JCYJ20160331141459373), 광동 홍 (GHP / 012 / 16GD), 홍콩 연구 기금위원회 (15101014), 홍콩 폴리 테크닉 대학 (G-YBGQ), 닝보 대학의 KC 웡 마그나 기금 등이있다.

모든 절차는 실험실 동물의 관리와 사용을위한 국립 보건원 (NIH) 안내서 (NIH Publications No. 80-23, 1996 년 개정)를 따르고 Ningbo University의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) SYXK-2008-0110). 1. 솔루션 및 문화 미디어의 준비 참고 : 시약 및 스톡은 무균 조건에서 준비해야합니다. 구멍 크기가 0.22 μm 인 필터를 사용하여 필터링하여 소독하십시오. <ol><li> 이중 ?...

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirubin-3-oxime+prevents+H2O2-induced+neuronal+apoptosis+via+concurrently+inhibiting+GSK3beta+and+the+ERK+pathway.">Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway.</a> Cell Mol Neurobiol. , (2016).</li><li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-cancer+agent+SU4312+unexpectedly+protects+against+MPP(+)+-induced+neurotoxicity+via+selective+and+direct+inhibition+of+neuronal+NOS.">The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS.</a> Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).</li><li>Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Depletion+of+Microglia+from+Cerebellar+Granule+Cell+Cultures+Using+L-leucine+Methyl+Ester.">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J Vis Exp. (101), e52983 (2015).</li><li>Labno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Two way to count cells with ImageJ. , (2008).</li><li>Haag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nos2+Inactivation+promotes+the+development+of+medulloblastoma+in+Ptch1(+/-)+mice+by+deregulation+of+Gap43-dependent+granule+cell+precursor+migration.">Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration.</a> Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), e990 (2009).</li><li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture.">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+acetylcholinesterase+inhibitor+bis7-tacrine,+but+not+donepezil,+prevents+glutamate-induced+neuronal+apoptosis+by+blocking+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Cheung, G., Cousin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+synaptic+vesicle+pool+replenishment+in+cultured+cerebellar+granule+neurons+using+FM+Dyes.">Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes.</a> J Vis Exp. (57), e3143 (2011).</li><li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genistein+and+daidzein+prevent+low+potassium-dependent+apoptosis+of+cerebellar+granule+cells.">Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).</li><li>Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+cultured+neuronal+and+glial+cells+respond+differently+to+toxicity+of+unconjugated+bilirubin.">Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin.</a> Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).</li><li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium/serum+deprivation.">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li><li>Garner, D. L., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Assessment+of+Mammalian+Sperm+Using+Sybr-14+and+Propidium+Iodide.">Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide.</a> Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).</li></ol>

이 프로토콜은 앞에서 설명한 절차 6 , 7 에서 수정되었습니다. 연구원은 체외에서 일차 뉴런 을 배양 할 때 조건을 개선하여 비 신경 세포 성장을 줄이기 위해 시간을 보냈습니다. 그러나, 개선 된 배양 조건으로도, 일부의 신경아 교세포가 남아있다. 또한, 그들은 신경 세포의 성장과 성숙을 도와주기 때문에 비 연결 세포가 기본 신경 세?...

3- (4,5- 디메틸 -2- 티아 졸릴) -2,5- 디 페닐 -2-H- 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석과 같은 비색 세포 독성 분석은 일반적으로 시험 관내에서 세포 생존력을 측정하는 데 사용됩니다. 쥐의 일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 1- 메틸 -4- 페닐 피리 디늄 이온, 과산화수소 및 글루 탐 산염 1,2를 비롯한 다양한 신경 독소에 민감합니다. 따라서 CGN 배양 물은 신경 과학 분야 의 시험 관내 모델로 사용될 수 있습니다. CGN 배양 물은 CGN 배양에서 총 세포의 약 1 %를 차지할 수있는 뉴런 및 신경교 세포를 포함하는 다양한 세포를 함유 할 수있다. 그러나 신경 교세포는 뉴런에 비해 신경 독소에 다르게 반응하여 비색 분석 3 에 의해 측정 된 신경 세포 생존력에 편향을 일으 킵니다. 살아있는 세포에서 Fluorescein diacetate (FDA)는 에스 테라 제에 의해 플루 오레 신으로 전환 될 수 있습니다.Propidium Iodide (PI)는 죽은 세포를 통과 한 후 DNA와 상호 작용할 수 있으며 배양 물 내에서 세포 사멸을 나타내는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 FDA-PI 이중 염색은 생존 가능한 세포와 ​​죽은 세포를 동시에 평가할 수있어 비색법을 결합하여 세포 생존력을보다 정확하게 측정 할 수 있음을 시사합니다. 또한 핵에 파란색 형광 염료 인 Hoechst를 추가하여 세포 생존력의 정확성을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 FDA-PI 이중 염색법과 FDA-PI-Hoechst triple 염색법을 설명하며, 일차 배양 CGN에서의 신경 생존력을 정확하게 분석하는데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 크기와 모양으로 CGN과 glial 세포를 시각화하고 구별하는 것을 이용합니다. 염색 후, 생존 가능한 뉴런과 죽은 뉴런의 수는 형광 현미경으로 촬영 한 대표 이미지로부터 계산됩니다. 대형 glial 세포는 전형적인 CGNs의 비교에 의해 제외됩니다형광등 모드에서 위상차 모드로 촬영 한 것입니다. 유사한 전략은 일차 피질 문화와 해마 문화와 같은 뉴런과 glial 세포를 포함하는 혼합 세포 배양에서의 연결 생존 능력을 측정하기 위해 수행 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141&#160;</td>
			<td>high quality FBS is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; anti-biotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21010046&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Yesen</td>
			<td>40731ES10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit Anti-GAP43 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>3670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A602440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Volac</td>
			<td>Z310727</td>
			<td>burn&#160; the tip round before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707759</td>
			<td>high quality cell culture plate&#160; is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 5 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 10 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissect microscope</td>
			<td>Shanghai Caikang</td>
			<td>XTL2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter and emmision cubes</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>B-2A, G-2A, UV-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics editor softeware</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image process softeware</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture

일차 배양 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 시험 관내 모델로서 널리 사용되어왔다. 그러나, CGN 배양에서 신경 교세포와 뉴런의 공존은 신경 세포 생존 능력의 정확한 평가에서 편차를 유발할 수있다. Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색법은 생존 및 사멸 세포를 동시에 평가함으로써 세포 생존력을 측정하는 데 사용되었습니다. 우리는 비색 분석법의 민감도를 향상시키고 CGNs의 신경 생존 능력을 평가하기 위해 FDA-PI 이중 염색법을 사용했습니다. 또한 정확도를 높이기 위해 청색 형광 DNA 얼룩 ( 예 : Hoechst)을 추가했습니다. 이 프로토콜은 CGN 문화에서 이러한 방법을 사용하여 연결 가능성의 평가의 정확성을 향상시키는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 형광 현미경을 사용하여 glial 세포의 수를 제외 할 수 있습니다. 비슷한 전략을 적용하여 원치 않는 gli를 구별 할 수 있습니다.대뇌 피질의 배양 및 해마 배양과 같은 다양한 혼합 세포 배양에서 뉴런의 알 세포.

GAP43 (적색)과 GFAP (녹색)의 이중 immunostaining는 각각 신경 세포와 glial 세포의 모양을 분석하는 데 사용되었다 2 , 5 . 두 뉴런과 glial 세포는 CGN 문화에 존재합니다. GFAP 양성 glial 세포는 이미지의 화살표로 표시된대로 크고 불규칙한 모양입니다 ( 그림 1 ). 세포 활력에 대한 전통적인 분석은 신경 생존력을 측정하는 데 ...

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Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

이 프로토콜은 신경 과학 및 신경 약리학 연구 에서 체외 모델로 사용되는 배양 소뇌 과립 뉴런 (neuronal culture)의 Fluorescein diacetate (FDA) 및 Propidium Iodide (PI) 이중 염색을 사용하여 신경 생존력을 정확하게 측정하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포 배양에서 Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide 이중 염색을 이용한 신경 생존력의 평가

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

연구

신경과학

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

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마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

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During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

소뇌 과립 세포 배양에서 미세 아교 세포의 선택적 고갈 L - 류신 메틸 에스테르를 사용하여

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