Name: assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture
Uploaded: 2017-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Naturvitenskapsstiftelsen i Zhejiang-provinsen (LY15H310007), Applied Research Project on Nonprofit Technology of Zhejiang-provinsen (2016C37110), National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407), Ningbo International Science and Technology Cooperation Project (2014D10019), Ningbo kommunale innovasjonsteam for livsvitenskap og helse (2015C110026), Guangdong Provincial Internasjonalt Samarbeidsprosjekt for Vitenskap og Teknologi (nr. 2013B051000038), Shenzhen Basic Research Program (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong Kong Technology Co-ordning Scheme (GHP / 012 / 16GD), Research Grants Council of Hong Kong (15101014), Hong Kong Polytechnic University (G-YBGQ) og KC Wong Magna Fund ved Ningbo University.

Alle prosedyrer fulgte National Institutes of Health (NIH) Guide for pleie og bruk av laboratoriedyr (NIH-publikasjoner nr. 80-23, revidert 1996) og ble godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk (IACUC) ved Ningbo University SYXK-2008-0110). 1. Fremstilling av løsninger og kulturmedier Merk: Reagenser og lagre må fremstilles under sterile forhold. Steriliser ved filtrering ved å bruke et filter med en porestørrelse på 0,22 μm. <ol><li> Forbered Poly-L-L...

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirubin-3-oxime+prevents+H2O2-induced+neuronal+apoptosis+via+concurrently+inhibiting+GSK3beta+and+the+ERK+pathway.">Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway.</a> Cell Mol Neurobiol. , (2016).</li><li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-cancer+agent+SU4312+unexpectedly+protects+against+MPP(+)+-induced+neurotoxicity+via+selective+and+direct+inhibition+of+neuronal+NOS.">The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS.</a> Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).</li><li>Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Depletion+of+Microglia+from+Cerebellar+Granule+Cell+Cultures+Using+L-leucine+Methyl+Ester.">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J Vis Exp. (101), e52983 (2015).</li><li>Labno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Two way to count cells with ImageJ. , (2008).</li><li>Haag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nos2+Inactivation+promotes+the+development+of+medulloblastoma+in+Ptch1(+/-)+mice+by+deregulation+of+Gap43-dependent+granule+cell+precursor+migration.">Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration.</a> Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), e990 (2009).</li><li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture.">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+acetylcholinesterase+inhibitor+bis7-tacrine,+but+not+donepezil,+prevents+glutamate-induced+neuronal+apoptosis+by+blocking+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Cheung, G., Cousin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+synaptic+vesicle+pool+replenishment+in+cultured+cerebellar+granule+neurons+using+FM+Dyes.">Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes.</a> J Vis Exp. (57), e3143 (2011).</li><li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genistein+and+daidzein+prevent+low+potassium-dependent+apoptosis+of+cerebellar+granule+cells.">Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).</li><li>Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+cultured+neuronal+and+glial+cells+respond+differently+to+toxicity+of+unconjugated+bilirubin.">Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin.</a> Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).</li><li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium/serum+deprivation.">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li><li>Garner, D. L., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Assessment+of+Mammalian+Sperm+Using+Sybr-14+and+Propidium+Iodide.">Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide.</a> Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).</li></ol>

Denne protokollen ble modifisert fra prosedyrer som er blitt beskrevet tidligere 6 , 7 . Forskere har brukt tid på å redusere ikke-neuronal cellevekst ved å forbedre forholdene når de dyrker primære neuroner in vitro 8 . Imidlertid, selv med forbedrede kulturforhold, forblir noen glialceller. Videre er ikke-neuronale celler nødvendige i primære nevronkulturer fordi de bidrar til nevron vekst og modning 9<...

Klarimetriske cytotoksisitetsanalyser, slik som 3- (4, 5-dimetyl-2-tiazolyl) -2, 5-difenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT) -assayet, blir ofte brukt til å måle celle-levedyktighet in vitro . Primærkulturerte Cerebellar Granule Neurons (CGN) fra rotter er følsomme overfor forskjellige nevrotoksiner, inkludert 1-metyl-4-fenylpyridiniumion, hydrogenperoksid og glutamat 1,2. Derfor kan CGN-kulturer brukes som en in vitro- modell innen nevrovitenskap. CGN-kulturer kan inneholde en rekke celler, inkludert nevroner og glialceller, som kan utgjøre om lag 1% av de totale cellene i CGN-kulturen. Glialceller reagerer imidlertid annerledes på nevrotoksiner sammenlignet med nevroner, noe som fører til en forspenning i neuronal levedyktighet målt ved kolorimetriske analyser 3 . I levedyktige celler kan fluoresceindiacetat (FDA) omdannes til fluorescein med esterase.Propidiumjodid (PI) kan samhandle med DNA etter å ha penetrert døde celler og kan brukes til å indikere apoptose i kulturen. Derfor kan FDA-PI-dobbeltfarging samtidig evaluere levedyktige celler og døde celler, noe som tyder på at cellens levedyktighet kan måles mer nøyaktig ved å kombinere begge kolorimetriske metoder. Videre, ved å legge til Hoechst, en blå fluorescerende flekk for kjerner, kunne nøyaktigheten av celle-levedyktighet ytterligere forbedres. Protokollen som presenteres her beskriver FDA-PI dobbeltfarging og FDA-PI-Hoechst triple-farging, som kan brukes til å nøyaktig analysere neuronal levedyktighet i primære dyrkede CGNs. Denne protokollen benytter seg av å visualisere og skille mellom CGN og glialceller i forskjellige størrelser og former. Etter farging regnes antall levedyktige nevroner og døde nevroner fra representative bilder tatt av fluorescerende mikroskopi. De store glialcellene er ekskludert ved sammenligning av typiske CGNs tAken under fluorescerende modus med de som er tatt under fasekontrastmodus. En lignende strategi kan utføres for å måle neuronal levedyktighet i blandede cellekulturer som inneholder nevroner og glialceller, slik som primære kortikale kulturer og hippokampkulturer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141&#160;</td>
			<td>high quality FBS is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; anti-biotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21010046&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Yesen</td>
			<td>40731ES10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit Anti-GAP43 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>3670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A602440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Volac</td>
			<td>Z310727</td>
			<td>burn&#160; the tip round before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707759</td>
			<td>high quality cell culture plate&#160; is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 5 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 10 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissect microscope</td>
			<td>Shanghai Caikang</td>
			<td>XTL2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter and emmision cubes</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>B-2A, G-2A, UV-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics editor softeware</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image process softeware</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture

Primærkulturerte Cerebellar Granule Neurons (CGNs) har blitt mye brukt som en in vitro- modell i nevrovitenskap og neurofarmakologiforskning. Sameksistensen av glialceller og nevroner i CGN-kulturen kan imidlertid føre til forstyrrelser i den nøyaktige vurderingen av neuronal levedyktighet. Fluoresceindiacetat (FDA) og Propidium Iodide (PI) dobbeltfarging har blitt brukt til å måle celle-levedyktighet ved samtidig evaluering av levedyktige og døde celler. Vi brukte FDA-PI dobbeltfarging for å forbedre sensitiviteten til de kolorimetriske analysene og å evaluere neuronal levedyktighet i CGNs. Videre tilsatte vi blå fluorescerende DNA-flekker ( f.eks. Hoechst) for å forbedre nøyaktigheten. Denne protokollen beskriver hvordan man kan forbedre nøyaktigheten av vurderingen av neuronal levedyktighet ved å bruke disse metodene i CGN-kulturen. Ved hjelp av denne protokollen kan antall glialceller utelukkes ved bruk av fluorescensmikroskopi. En lignende strategi kan brukes for å skille mellom uønskede gliAlceller fra nevroner i forskjellige blandede cellekulturer, slik som primær kortikultur og hippocampalkultur.

Den dobbelte immunostaining av GAP43 (rød) og GFAP (grønn) ble brukt til å analysere formen av nevroner og glialceller, henholdsvis 2 , 5 . Både nevroner og glialceller er tilstede i CGN-kultur. GFAP-positive glialceller er store og uregelmessige i form, som angitt av pilene i bildene ( figur 1 ). Tradisjonelle analyser for celle vitalitet kan ikke skille glialceller fra nevroner når de brukes til å måle n...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture at JoVE.com

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Denne protokollen beskriver hvordan man nøyaktig måler neuronal levedyktighet ved å bruke fluoresceindiacetat (FDA) og propidiumjodid (PI) dobbeltfarging i dyrkede cerebellargranulæreuroner, en primær nevronkultur som brukes som en in vitro- modell i nevrovitenskapelig og neurofarmakologisk forskning.

Vurdering av neuronal levedyktighet ved bruk av fluoresceindiacetat-propidiumjodid-dobbeltfarvning i cerebellar granulærneuronkultur

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analyse av Synaptic vesicle Pool Etterfylling i Cultured lillehjernen Granule Neurons bruker FM Fargestoffer

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analyse av Neuron til gliaceller samhandling i Microfluidic Kultur Platform (MCP)-baserte Neuronal Axon og gliaceller Co-kultur System

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetisk manipulering av Lillehjernen Granule Neuroner<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em&gt; Å studere nevrale morfologi og migrasjon

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex vivo avbildning av Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Bruke Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Selektiv Nedbryting av Microglia fra Cerebellar granulat cellekulturer ved hjelp av L-leucin MetylEster

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Low-Density Primær Hippocampus Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

En enkel neuronal mekanisk skademetode for å studere<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...