Name: assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture
Uploaded: 2017-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture at JoVE.com

Este trabalho foi suportado por concessões da fundação natural da ciência da província de Zhejiang (LY15H310007), o projeto aplicado da pesquisa na tecnologia sem fins lucrativos da província de Zhejiang (2016C37110), a fundação nacional da ciência natural de China (U1503223, 81673407) (2014D10019), a equipe de inovação municipal de Ningbo da ciência e da saúde de vida (2015C110026), o projeto provincial da cooperação internacional de Guangdong da ciência e da tecnologia (No. 2013B051000038), Shenzhen o programa básico da pesquisa (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong (GHP / 012 / 16GD), o Conselho de Bolsas de Pesquisa de Hong Kong (15101014), a Universidade Politécnica de Hong Kong (G-YBGQ) e o Fundo KC Wong Magna da Universidade de Ningbo.

Todos os procedimentos seguiram o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Publicações NIH No. 80-23, revisado em 1996) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) na Universidade de Ningbo ( SYXK-2008-0110). 1. Preparação de soluções e meios de cultura Nota: Reagentes e estoques precisam ser preparados em condições estéreis. Esterilizar por filtração utilizando u...

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirubin-3-oxime+prevents+H2O2-induced+neuronal+apoptosis+via+concurrently+inhibiting+GSK3beta+and+the+ERK+pathway.">Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway.</a> Cell Mol Neurobiol. , (2016).</li><li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-cancer+agent+SU4312+unexpectedly+protects+against+MPP(+)+-induced+neurotoxicity+via+selective+and+direct+inhibition+of+neuronal+NOS.">The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS.</a> Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).</li><li>Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Depletion+of+Microglia+from+Cerebellar+Granule+Cell+Cultures+Using+L-leucine+Methyl+Ester.">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J Vis Exp. (101), e52983 (2015).</li><li>Labno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Two way to count cells with ImageJ. , (2008).</li><li>Haag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nos2+Inactivation+promotes+the+development+of+medulloblastoma+in+Ptch1(+/-)+mice+by+deregulation+of+Gap43-dependent+granule+cell+precursor+migration.">Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration.</a> Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), e990 (2009).</li><li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture.">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+acetylcholinesterase+inhibitor+bis7-tacrine,+but+not+donepezil,+prevents+glutamate-induced+neuronal+apoptosis+by+blocking+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Cheung, G., Cousin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+synaptic+vesicle+pool+replenishment+in+cultured+cerebellar+granule+neurons+using+FM+Dyes.">Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes.</a> J Vis Exp. (57), e3143 (2011).</li><li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genistein+and+daidzein+prevent+low+potassium-dependent+apoptosis+of+cerebellar+granule+cells.">Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).</li><li>Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+cultured+neuronal+and+glial+cells+respond+differently+to+toxicity+of+unconjugated+bilirubin.">Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin.</a> Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).</li><li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium/serum+deprivation.">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li><li>Garner, D. L., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Assessment+of+Mammalian+Sperm+Using+Sybr-14+and+Propidium+Iodide.">Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide.</a> Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).</li></ol>

Este protocolo foi modificado a partir de procedimentos que foram descritos anteriormente 6 , 7 . Os pesquisadores passaram tempo tentando reduzir o crescimento de células não-neuronais melhorando as condições quando cultivando neurônios primários in vitro 8 . Contudo, mesmo com condições de cultura melhoradas, permanecem algumas células gliais. Além disso, células não-neuronais são necessárias em culturas neuronais...

Os ensaios de citotoxicidade colorimétrica, tais como o ensaio de brometo de 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difenil-2-H-tetrazólio (MTT), são comummente utilizados para medir a viabilidade celular in vitro . Os neurónios de grânulos cerebelosos (CGNs) cultivados primários de ratos são sensíveis a várias neurotoxinas, incluindo ião 1-metil-4-fenilpiridinio, peróxido de hidrogénio e glutamato 1 , 2 . Portanto, as culturas CGN podem ser usadas como um modelo in vitro no campo da neurociência. As culturas CGN podem conter uma variedade de células, incluindo neurónios e células gliais, que podem representar cerca de 1% das células totais na cultura CGN. No entanto, as células gliais respondem de forma diferente às neurotoxinas em comparação com os neurónios, levando a um viés na viabilidade neuronal medida por ensaios colorimétricos 3 . Em células viáveis, o diacetato de fluoresceína (FDA) pode ser convertido em fluoresceína por esterase.O iodeto de propídio (PI) pode interagir com o DNA após a penetração de células mortas e pode ser usado para indicar apoptose dentro da cultura. Por conseguinte, a coloração dupla FDA-PI pode simultaneamente avaliar células viáveis ​​e células mortas, sugerindo que a viabilidade celular pode ser medida com maior precisão pela combinação de ambos os métodos colorimétricos. Além disso, adicionando Hoechst, uma mancha fluorescente azul para núcleos, a precisão da viabilidade celular poderia ser melhorada. O protocolo aqui apresentado descreve a coloração dupla de FDA-PI e a coloração tripla FDA-PI-Hoechst, que pode ser utilizada para analisar com precisão a viabilidade neuronal em CGNs de cultura primária. Este protocolo aproveita-se de visualizar e distinguir CGNs e células gliais por seus diferentes tamanhos e formas. Após a coloração, o número de neurônios viáveis ​​e neurônios mortos são contados a partir de imagens representativas tomadas por microscopia fluorescente. As células gliais de tamanho grande são excluídas pela comparação de CGNs típicos tEm modo fluorescente com as tomadas em modo de contraste de fase. Uma estratégia semelhante pode ser realizada para medir a viabilidade neuronal em culturas de células misturadas contendo neurónios e células gliais, tais como culturas corticais primárias e culturas de hipocampo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141&#160;</td>
			<td>high quality FBS is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; anti-biotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21010046&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Yesen</td>
			<td>40731ES10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit Anti-GAP43 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>3670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A602440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Volac</td>
			<td>Z310727</td>
			<td>burn&#160; the tip round before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707759</td>
			<td>high quality cell culture plate&#160; is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 5 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 10 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissect microscope</td>
			<td>Shanghai Caikang</td>
			<td>XTL2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter and emmision cubes</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>B-2A, G-2A, UV-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics editor softeware</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image process softeware</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture

Os neurónios de grãos cerebelosos cultivados primários (CGNs) têm sido amplamente utilizados como um modelo in vitro em neurociência e investigação neurofarmacologia. No entanto, a coexistência de células gliais e neurônios na cultura CGN pode levar a viés na avaliação precisa da viabilidade neuronal. O diacetato de fluoresceína (FDA) e a coloração dupla de iodeto de propídio (PI) foram utilizados para medir a viabilidade celular ao avaliar simultaneamente as células viáveis ​​e mortas. Utilizou-se coloração dupla FDA-PI para melhorar a sensibilidade dos ensaios colorimétricos e avaliar a viabilidade neuronal em CGNs. Além disso, adicionamos manchas azuis fluorescentes de DNA ( por exemplo, Hoechst) para melhorar a precisão. Este protocolo descreve como melhorar a precisão da avaliação da viabilidade neuronal utilizando estes métodos na cultura CGN. Utilizando este protocolo, o número de células gliais pode ser excluído utilizando microscopia de fluorescência. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada para distinguir os gli indesejadosAl de neurónios em várias culturas de células misturadas, tais como cultura cortical primária e cultura de hipocampo.

A imunocoloração dupla de GAP43 (vermelho) e GFAP (verde) foi utilizada para analisar a forma dos neurônios e células gliais, respectivamente 2 , 5 . Tanto os neurónios como as células gliais estão presentes na cultura CGN. As células gliais GFAP-positivas são grandes e de forma irregular, como indicado pelas setas nas imagens ( Figura 1 ). Os ensaios tradicionais para a vitalidade celular não podem dis...

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Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Este protocolo descreve como medir com precisão a viabilidade neuronal usando fluoresceína diacetato (FDA) e Propidium Iodide (PI) dupla coloração em neurônios cultivados cerebrais grânulo, uma cultura primária neuronal utilizado como um modelo in vitro em neurociência e neuropharmacology investigação.

Avaliação da Viabilidade Neuronal Utilizando Coloração Dupla de Iodeto de Diacetate-Propidium de Fluoresceína em Cultura de Neurônio de Granulado Cerebelar

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Neurociência

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

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Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

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