Name: assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture
Uploaded: 2017-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Фонда естественных наук провинции Чжэцзян (LY15H310007), Проекта прикладных исследований некоммерческой технологии провинции Чжэцзян (2016C37110), Национального фонда естественных наук Китая (U1503223, 81673407), Нинбо Международной науки и Проект по технологическому сотрудничеству (2014D10019), Муниципальная инновационная группа по науке и здоровью Нинбо (2015C110026), Провинциальный проект по науке и технике провинции Гуандун (№ 2013B051000038), Программа научных исследований Шэньчжэня (JCYJ20160331141459373), Гуандун-Хонг (GHP / 012 / 16GD), Совет исследовательских грантов Гонконга (15101014), Гонконгский политехнический университет (G-YBGQ) и Фонд К.С.Вонга Магна в Университете Нинбо.

Все процедуры были выполнены в соответствии с руководством Национального института здравоохранения (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных (публикации NIH № 80-23, пересмотренный в 1996 году) и были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных (IACUC) в ?...

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirubin-3-oxime+prevents+H2O2-induced+neuronal+apoptosis+via+concurrently+inhibiting+GSK3beta+and+the+ERK+pathway.">Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway.</a> Cell Mol Neurobiol. , (2016).</li><li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-cancer+agent+SU4312+unexpectedly+protects+against+MPP(+)+-induced+neurotoxicity+via+selective+and+direct+inhibition+of+neuronal+NOS.">The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS.</a> Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).</li><li>Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Depletion+of+Microglia+from+Cerebellar+Granule+Cell+Cultures+Using+L-leucine+Methyl+Ester.">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J Vis Exp. (101), e52983 (2015).</li><li>Labno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Two way to count cells with ImageJ. , (2008).</li><li>Haag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nos2+Inactivation+promotes+the+development+of+medulloblastoma+in+Ptch1(+/-)+mice+by+deregulation+of+Gap43-dependent+granule+cell+precursor+migration.">Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration.</a> Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), e990 (2009).</li><li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture.">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+acetylcholinesterase+inhibitor+bis7-tacrine,+but+not+donepezil,+prevents+glutamate-induced+neuronal+apoptosis+by+blocking+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Cheung, G., Cousin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+synaptic+vesicle+pool+replenishment+in+cultured+cerebellar+granule+neurons+using+FM+Dyes.">Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes.</a> J Vis Exp. (57), e3143 (2011).</li><li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genistein+and+daidzein+prevent+low+potassium-dependent+apoptosis+of+cerebellar+granule+cells.">Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).</li><li>Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+cultured+neuronal+and+glial+cells+respond+differently+to+toxicity+of+unconjugated+bilirubin.">Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin.</a> Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).</li><li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium/serum+deprivation.">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li><li>Garner, D. L., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Assessment+of+Mammalian+Sperm+Using+Sybr-14+and+Propidium+Iodide.">Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide.</a> Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).</li></ol>

Этот протокол был изменен из процедур, которые были описаны ранее 6 , 7 . Исследователи потратили время, пытаясь уменьшить рост нейрональных клеток, улучшая условия культивирования первичных нейронов in vitro 8 . Однако даже при улучшенных ус...

Анализы колориметрической цитотоксичности, такие как анализ 3- (4, 5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2-Н-тетразолийбромид (МТТ), обычно используют для определения жизнеспособности клеток in vitro . Первичные культивируемые мозжечковые гранулы нейронов (CGN) у крыс чувствительны к различным нейротоксинам, включая ион 1-метил-4-фенилпиридиния, перекись водорода и глутамат 1 , 2 . Таким образом, культуры CGN могут использоваться как модель in vitro в области нейронауки. Культуры CGN могут содержать различные клетки, включая нейроны и глиальные клетки, которые могут составлять около 1% от общего количества клеток в культуре CGN. Однако глиальные клетки по-разному реагируют на нейротоксины по сравнению с нейронами, что приводит к смещению в жизнеспособности нейронов, измеренному колориметрическими анализами 3 . В жизнеспособных клетках диацетат флуоресцеина (FDA) может быть превращен в флуоресцеин эстеразой.Пропидий-йодид (PI) может взаимодействовать с ДНК после проникновения в мертвые клетки и может использоваться для указания апоптоза в культуре. Таким образом, двойное окрашивание FDA-PI может одновременно оценивать жизнеспособные клетки и мертвые клетки, предполагая, что жизнеспособность клеток может быть измерена более точно, комбинируя оба колориметрических метода. Более того, путем добавления Hoechst, синего флуоресцентного красителя для ядер, точность жизнеспособности клеток может быть дополнительно улучшена. Представленный здесь протокол описывает двойное окрашивание FDA-PI и тройное окрашивание FDA-PI-Hoechst, которое может быть использовано для точного анализа жизнеспособности нейронов в первичных культивируемых CGN. Этот протокол использует преимущества визуализации и различения CGN и глиальных клеток по их различным размерам и формам. После окрашивания число жизнеспособных нейронов и мертвых нейронов подсчитывают из репрезентативных изображений, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии. Крупные глиальные клетки исключаются путем сравнения типичных CGNs tAken под флуоресцентным режимом с режимами фазового контраста. Подобная стратегия может быть выполнена для измерения жизнеспособности нейронов в смешанных клеточных культурах, содержащих нейроны и глиальные клетки, такие как первичные корковые культуры и культуры гиппокампа.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141&#160;</td>
			<td>high quality FBS is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; anti-biotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21010046&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Yesen</td>
			<td>40731ES10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit Anti-GAP43 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>3670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A602440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Volac</td>
			<td>Z310727</td>
			<td>burn&#160; the tip round before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707759</td>
			<td>high quality cell culture plate&#160; is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 5 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 10 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissect microscope</td>
			<td>Shanghai Caikang</td>
			<td>XTL2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter and emmision cubes</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>B-2A, G-2A, UV-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics editor softeware</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image process softeware</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture

Первичные культивируемые мозжечковые гранулы нейронов (CGNs) широко используются в качестве модели in vitro в исследованиях нейрофизиологии и нейрофармакологии. Однако сосуществование глиальных клеток и нейронов в культуре CGN может привести к искажениям в точной оценке жизнеспособности нейронов. Двойное окрашивание флуоресцеина диацетата (FDA) и пропидий-йодида (PI) используется для измерения жизнеспособности клеток путем одновременной оценки жизнеспособных и мертвых клеток. Мы использовали двойное окрашивание FDA-PI для улучшения чувствительности колориметрических анализов и оценки жизнеспособности нейронов в CGN. Кроме того, мы добавили синие флуоресцентные пятна ДНК ( например, Hoechst) для улучшения точности. Этот протокол описывает, как улучшить точность оценки жизнеспособности нейронов, используя эти методы в культуре CGN. Используя этот протокол, количество глиальных клеток может быть исключено с помощью флуоресцентной микроскопии. Аналогичная стратегия может быть применена, чтобы отличить нежелательные глиAl клетки из нейронов в различных культурах смешанных клеток, таких как первичная корковая культура и культура гиппокампа.

Двойное иммуноокрашивание GAP43 (красный) и GFAP (зеленый) использовали для анализа формы нейронов и глиальных клеток, соответственно 2 , 5 . Оба нейрона и глиальных клеток присутствуют в культуре CGN. GFAP-положительные глиальные клетки большие ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture at JoVE.com

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Этот протокол описывает, как точно измерить жизнеспособность нейронов с использованием двойного окрашивания флуоресцеина диацетата (FDA) и пропидиум-йодида (PI) в культивируемых нейронах гранул мозжечка, первичной нейрональной культуре, используемой в качестве модели in vitro в исследованиях нейронауки и нейрофармакологии.

Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Количественный анализ Synaptic пополнение бассейна пузырьков в культуре нейронов мозжечка гранул использованием FM Красители

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Анализ изображений нейрона к Glia Взаимодействие в Микрофлюидных Платформа культуры (MCP) на основе нейронных аксонов и глии Co-культуре системы

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Генетических манипуляций мозжечка Granule нейронов<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em&gt; По изучению нейронных Морфология и миграция

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Экс естественных изображений послеродовой мозжечка ЗК миграции с помощью конфокальной макроскопии

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Низкая плотность первичного гиппокамп Нейрон культура

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Моделирования нейронов смерти и дегенерации в мышь первичной мозжечковой гранул нейронов

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Методология простой нейронной механической травмы для изучения<em&gt; Drosophila</em&gt; Дегенерация моторных нейронов

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Оценка долгосрочной депрессии индукции в взрослых церебеллярной ломтики

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...