Name: assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture
Uploaded: 2017-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture at JoVE.com

Bu çalışma, Zhejiang Eyaleti Doğal Bilim Vakfı (LY15H310007), Zhejiang Eyaletinin Kar Amacı Gütmeyen Teknoloji (2016C37110) Uygulamalı Araştırma Projesi, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U1503223, 81673407), Ningbo Uluslararası Bilim ve (2014D10019), Yaşam Bilim ve Sağlık Ningbo Belediye Yenilik Ekibi (2015C110026), Guangdong Eyalet Bilim ve Teknoloji Uluslararası İşbirliği Projesi (2013B051000038), Shenzhen Temel Araştırma Programı (JCYJ20160331141459373), Guangdong-Hong Kong Teknolojisi İşbirliği Fonlama Programı (GHP / 012 / 16GD), Hong Kong Araştırma Dekanlığı Konseyi (15101014), Hong Kong Politeknik Üniversitesi (G-YBGQ) ve Ningbo Üniversitesi&#39;ndeki KC Wong Magna Fonu.

Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu&#39;na (NIH Yayınları No. 80-23, 1996&#39;da revize edilmiştir) ve Ningbo Üniversitesi&#39;ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ( SYXK-2008-0110). 1. Çözeltilerin ve Kültür Ortamlarının Hazırlanması Not: Reaktifler ve stokların steril koşullar altında hazırlanması gerekir. 0.22 μm g...

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirubin-3-oxime+prevents+H2O2-induced+neuronal+apoptosis+via+concurrently+inhibiting+GSK3beta+and+the+ERK+pathway.">Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway.</a> Cell Mol Neurobiol. , (2016).</li><li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-cancer+agent+SU4312+unexpectedly+protects+against+MPP(+)+-induced+neurotoxicity+via+selective+and+direct+inhibition+of+neuronal+NOS.">The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS.</a> Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).</li><li>Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Depletion+of+Microglia+from+Cerebellar+Granule+Cell+Cultures+Using+L-leucine+Methyl+Ester.">Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester.</a> J Vis Exp. (101), e52983 (2015).</li><li>Labno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Two way to count cells with ImageJ. , (2008).</li><li>Haag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nos2+Inactivation+promotes+the+development+of+medulloblastoma+in+Ptch1(+/-)+mice+by+deregulation+of+Gap43-dependent+granule+cell+precursor+migration.">Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration.</a> Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), e990 (2009).</li><li>Messer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+and+identification+of+mouse+cerebellar+granule+cells+in+monolayer+culture.">The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture.</a> Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dimeric+acetylcholinesterase+inhibitor+bis7-tacrine,+but+not+donepezil,+prevents+glutamate-induced+neuronal+apoptosis+by+blocking+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Cheung, G., Cousin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+synaptic+vesicle+pool+replenishment+in+cultured+cerebellar+granule+neurons+using+FM+Dyes.">Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes.</a> J Vis Exp. (57), e3143 (2011).</li><li>Atlante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genistein+and+daidzein+prevent+low+potassium-dependent+apoptosis+of+cerebellar+granule+cells.">Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).</li><li>Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+cultured+neuronal+and+glial+cells+respond+differently+to+toxicity+of+unconjugated+bilirubin.">Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin.</a> Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).</li><li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+cerebellar+granule+neurons+undergoing+apoptosis+by+potassium/serum+deprivation.">Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation.</a> Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).</li><li>Garner, D. L., Johnson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Assessment+of+Mammalian+Sperm+Using+Sybr-14+and+Propidium+Iodide.">Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide.</a> Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).</li></ol>

Bu protokol, daha önce 6 , 7&#39;de açıklanan prosedürlerden değiştirildi. Araştırmacılar in vitro olarak birincil nöronlar kültür ederken koşulları iyileştirerek nöronal olmayan hücre büyümesini azaltmaya çalışmak için zaman harcadılar. Bununla birlikte, gelişmiş kültür koşullarıyla bile, bazı glial hücreler kalır. Ayrıca, nöronal büyüme ve olgunlaşma ile yardımcı oldukları için, primer nöronal kültürlerde n...

3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2-H-tetrazolyum bromür (MTT) tahlili gibi kolorimetrik sitotoksiklik testleri , hücre canlılığını in vitro olarak ölçmek için yaygın olarak kullanılır. Sıçanlardan alınan primer kültüre edilmiş Serebellar Granül Nöronları (CGN&#39;ler) 1-metil-4-fenilpiridinyum iyonu, hidrojen peroksit ve glutamat 1 , 2 de dahil olmak üzere çeşitli nevrotoksinlere duyarlıdır. Bu nedenle, CGN kültürleri sinirbilimi alanında in vitro bir model olarak kullanılabilir. CGN kültürleri, CGN kültüründeki toplam hücrelerin yaklaşık% 1&#39;ini oluşturabilen nöronlar ve glial hücreler de dahil olmak üzere çeşitli hücreler içerebilir. Bununla birlikte, glial hücreler, nöronlara kıyasla nörotoksinlere farklı şekilde tepki verirler, bu da kolorimetrik testler 3 ile ölçülen nöronal canlılığın önyargısına neden olurlar. Canlı hücrelerde, floresein diasetat (FDA), esteraz ile floreseine dönüştürülebilir.Propidyum iyodür (PI) ölü hücrelere nüfuz ettikten sonra DNA ile etkileşime girebilir ve kültür içinde apoptozu göstermek için kullanılabilir. Bu nedenle, FDA-PI çift boyama, canlı hücre ve ölü hücreleri aynı anda değerlendirebilir, bu da, her iki kolorimetrik yöntemi birleştirerek hücrenin yaşayabilirliğinin daha doğru bir şekilde ölçülebileceğini düşündürür. Ayrıca, çekirdekler için mavi bir flüoresan lekesi olan Hoechst eklenerek hücre canlılığının doğruluğu daha da geliştirilebilir. Burada sunulan protokol, primer kültürlenmiş CGN&#39;lerin nöronal canlılığını doğru bir şekilde analiz etmek için kullanılabilen FDA-PI çift boyama ve FDA-PI-Hoechst üçlü boyamayı anlatmaktadır. Bu protokol CGN&#39;leri ve glial hücreleri farklı boyut ve şekillerle görselleştirmek ve ayırt etmekten yararlanmaktadır. Boyama sonrasında, canlı nöronların ve ölü ölü hücrelerin sayıları, flüoresan mikroskobu ile alınan temsili görüntülerden sayılır. Büyük boyutlu glial hücreler, tipik CGN&#39;lerin karşılaştırılmasıyla hariç tutulurFloresan modu altında afiş kontrast modunda alınan ile. Primer kortikal kültürler ve hipokampal kültürler gibi nöronlar ve glial hücreler içeren karışık hücre kültürlerinde nöronal canlılığı ölçmek için benzer bir strateji uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-Arabinofuranoside</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10099141&#160;</td>
			<td>high quality FBS is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#215; anti-biotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21010046&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Yesen</td>
			<td>40731ES10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit Anti-GAP43 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab75810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Cellsignaling</td>
			<td>3670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A602440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Volac</td>
			<td>Z310727</td>
			<td>burn&#160; the tip round before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>Z707759</td>
			<td>high quality cell culture plate&#160; is essential for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 5 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet 10 ml</td>
			<td>Excell Bio</td>
			<td>CS017-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissect microscope</td>
			<td>Shanghai Caikang</td>
			<td>XTL2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence filter and emmision cubes</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>B-2A, G-2A, UV-2A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphics editor softeware</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Photoshop CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image process softeware</td>
			<td>NIH</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of neuronal viability using fluorescein diacetate-propidium iodide double staining in cerebellar granule neuron culture

Primer kültürlü Serebellar Granül Nöronları (CGN&#39;ler) sinirbilimi ve nörofarmakoloji araştırmalarında in vitro bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, CGN kültüründe glial hücrelerin ve nöronların bir arada bulunması, nöronal canlılığın doğru bir şekilde değerlendirilmesinde önyargılara neden olabilir. Flöresein diasetat (FDA) ve Propidium Iodide (PI) çift boyama, canlı ve ölü hücreleri aynı anda değerlendirerek hücre yaşayabilirliğini ölçmek için kullanılmıştır. Kolorimetrik deneylerin duyarlılıklarını arttırmak ve CGN&#39;lerde nöronal canlılığı değerlendirmek için FDA-PI çift boyamayı kullandık. Ayrıca, doğruluğunu artırmak için mavi floresan DNA lekelerini ( örn. Hoechst) ekledik. Bu protokol, CGN kültüründe bu yöntemleri kullanarak nöronal canlılığın değerlendirilmesinin doğruluğunu nasıl geliştireceğini açıklar. Bu protokolü kullanarak, glial hücrelerin sayısı floresan mikroskopisi kullanılarak çıkarılabilir. Benzer bir strateji istenmeyen gliyi ayırt etmek için de uygulanabilirÇeşitli hücrelerde, örneğin birincil kortikal kültür ve hipokampal kültürdeki nöronlardan hücreler.

GAP43 (kırmızı) ve GFAP (yeşil) ikili immün boyama, sırasıyla nöron ve glial hücrelerin şeklini analiz etmek için kullanıldı 2 , 5 . CGN kültüründe hem nöronlar hem de glial hücreler bulunur. GFAP pozitif glial hücreler görüntülerdeki oklarla gösterildiği şekilde büyük ve düzensizdir ( Şekil 1 ). Hücre canlılığı için geleneksel tahliller, nöronal canlılığı ölçmek için ku...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture at JoVE.com

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Bu protokol, nörobilim ve nörofarmakoloji araştırmalarında in vitro bir model olarak kullanılan birincil nöronal kültür olan kültürlenmiş serebellar granül nöronlarında Fluorescein diasetat (FDA) ve Propidyum İyodür (PI) çift boyasını kullanarak nöronal canlılığı nasıl doğru bir şekilde ölçtüğümü açıklamaktadır.

Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Çalışmak İçin Basit Bir Nöronal Mekanik Yaralanma Metodolojisi<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Nöron Dejenerasyonu

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Erişkin Serebellar Dilimlerde Uzun Süreli Depresyon İndüksiyonunun Değerlendirilmesi

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...