Name: analysis of termination of transcription using brutp-strand-specific transcription run-on (tro) approach
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach at JoVE.com

Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.

MERK: Denne metoden ble brukt i forskningsartikkelen rapportert i Medler, S og Ansari, A. 2. 1. dyrking og høsting av celler <ol><li> Begynn en 5 ml kultur av celler i YPD-medium (10 g / l gjærekstrakt, 20 g / l pepton, 2% dekstrose) fra en fersk streket Saccharomyces cerevisiae plate. </li><li> Dyrke cellene over natten i en orbital ristemaskin ved 30 ° C og 250 rpm. </li><li> Fortynn over natten dyrket kultur 100 ganger til et sluttvolum på 100 ml i Y...

<ol>
	<li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast.">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li><li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription.">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586 (2015).</li><li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases.">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li><li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disengaging+polymerase:+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast.">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li><li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome:+why,+where+and+how+to+stop.">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li><li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+eukaryotic+transcriptome:+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs.">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li><li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast.">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li><li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast.">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li><li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reality+of+pervasive+transcription.">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625 (2011).</li><li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast.">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li><li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+(3C).">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15 (2012).</li><li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters.">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li></ol>

Strand-spesifikk TRO protokollen som brukes her var tilpasset fra protokollen som brukes for GRO-Seq (Global Run On-sekvensering) analyse i pattedyrceller 12. Vi lykkes modifisert protokollen for å studere gryende transkripsjon i spirende gjær. Å spesielt analysere transkripsjonstermineringskodende feil, vi justert protokollen ytterligere ved å bli kvitt den RNA hydrolysetrinnet. Dette tillot oss å spesifikt oppdage full lengde gryende transkripsjoner at initiert fra transkripsjon start sted...

Den eukaryote transkripsjons syklus består av tre hovedtrinn; initiering, forlengelse og avslutning. Avviklingen av transkripsjon av RNA polymerase II består av to atskilte, gjensidig avhengige trinn 3. Det første trinnet innebærer cleavage, polyadenylering og frigjøring av mRNA fra malen, og umiddelbart etterfølges av det andre trinnet, preget av frigjøring av polymerase fra malen. Riktig terminering er avgjørende for resirkulering av polymerase under oppstart / reinitiation av transkripsjon, for å hindre interferens med transkripsjon av nedstrømsgener, og for å holde avvikende transkripsjon i sjakk ved å begrense transkripsjon av gjennomgripende ikke-kodende RNA 4, 5. Til tross for de siste fremskritt, er oppsigelse langt den minst forståtte trinn av RNA polymerase II transkripsjon syklus. En pålitelig avslutning assay er avgjørende for å studere mekanismen underlying terminering av transkripsjon av RNA-polymerase II in vivo. En rekke eksperimentelle tilnærminger benyttes for å påvise opphør defekten i en aktivt transkribere genet under fysiologiske betingelser. Disse inkluderer Northern blot, oppsigelse faktor brikke (Chromatin Immunpresipitasjon) og den tradisjonelle TRO analysen. Hver av disse teknikkene har noen fordeler og ulemper. Den tradisjonelle TRO test som benyttes for å være de mest pålitelige og følsomme metode for påvisning av en transkripsjonsterminerings defekt i vivo en. Denne analyse lokaliserer den transkripsjonelt aktive polymerasemolekyler på forskjellige områder av et gen inne i cellen. Under normale forhold, viser analysen transkripsjonelt engasjerte polymerasemolekyler strengt fordelt mellom promotoren og terminator-regionen til genet (figur 1A). Ved mangelfull avslutning, men er ute av stand til å lese termineringssignal polymerasenog detekteres i området nedstrøms for 3&#39;-enden av genet (figur 1B). En transkripsjonsterminerings feil er manifestert i nærvær av en følelse-transkribere polymerase som initieres fra promotoren-proksimale område, og blir ute av stand til å lese termineringssignal, fortsetter å transkribere den regionen nedstrøms for 3&#39;-enden av et gen som vist på figur 2A. Med erkjennelsen av at det eukaryote genom viser overveldende gripende transkripsjon i fornuft samt anti-sense retninger i og rundt et gen 6, 7, 8, 9, 10, ble det snart klart at den tradisjonelle TRO analysen ikke kan oppdage om polymerase signal nedstrøms fra et gen som representerer en promoter-initiert transkripsjon (figur 2A) eller en avvikende RNA som initieres somewhere i midten av genet eller nedstrøms av terminatoren elementet (figur 2B), eller polymerasen transkribere i anti-sense-retning fra 3&#39;-enden av genet (figur 2C). Strand-spesifikk TRO analysen bruker BrUTP beskrevet her kan skille hvis den observerte gjennomlesning polymerase signal representerer promoter-initiert utvidet forstand mRNA eller en anti-sense transkripsjon som startet nedstrøms fra genet under eksamen. Vi har med hell brukt denne tilnærmingen til å demonstrere rolle Kin28 kinase i oppsigelse av transkripsjon i spirende gjær 2. Ansette tilnærming her viser vi at Rna14 kreves for terminering av transkripsjon av ASC1 i spirende gjær.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77619</td>
			<td>pH 4-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, human placenta</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU beads</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-32323AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protoscript II</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M03368L</td>
			<td>or an equivalent enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advantage 2 polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>639201</td>
			<td>or an equivalent enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromouridine 5&#39; triphosphate sodium salt</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-214314A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0451AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td></td>
			<td>N0454AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td></td>
			<td>N0452AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>MC Labs</td>
			<td>UBSA-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GAACTTTATACATATTCTTAGTT 
			AGCAGTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 D</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGTACATATGTATTTTCGCAGCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 F</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CTATGGAATGGGGGTTTTAAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asc1 G</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5s cDNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#8217; 5s reverse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#8217; 5s reverse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of termination of transcription using brutp-strand-specific transcription run-on (tro) approach

Dette manuskriptet beskriver en protokoll for påvisning av transkripsjonsterminerings defekt in vivo. Tråden spesifikke TRO protokollen ved hjelp av BrUTP er beskrevet her er en kraftfull eksperimentell tilnærming for analyse av transkripsjonsterminerings defekten under fysiologiske betingelser. Som den tradisjonelle TRO analysen, den er avhengig av tilstedeværelse av et transkripsjonelt aktivt polymerase forbi 3&#39;-enden av genet som en indikator på en transkripsjonsterminerings defekt 1. Det overvinner to store problemene med den tradisjonelle TRO analysen. For det første kan det oppdage om polymerasen lese gjennom termineringssignal er den som initieres transkripsjon fra promotoren-proksimale område, eller om det er ganske enkelt representere en pervasively transkripsjon av polymerase som initieres ikke-spesifikt fra et sted i kroppen, eller den 3&#39;- enden av genet. For det andre kan det skille hvis den transkripsjonelt aktive polymerase signal utoverterminator regionen er virkelig gjennomlesning fornuft mRNA transkribere polymerase eller en terminator-initierte ikke-kodende anti-sense RNA signal. I korthet innebærer den protokoll permeabilizing de eksponentielt voksende gjærceller, slik at transkriptene som igang in vivo til å forlenges i nærvær av BrUTP nukleotid, rense BrUTP-merket RNA av affiniteten tilnærming, revers transkribere det rensede begynnende RNA og amplifisere cDNA ved hjelp tråd-spesifikke primere som flankerer promotoren og terminator-regioner av genet to.

For å demonstrere anvendelsen av BrUTP-strand spesifikke TRO prosedyre i å oppdage en transkripsjon oppsigelse defekt, brukte vi en avslutning-defekt, temperaturfølsom mutant av RNA14 kalt rna14-1. Rollen Rna14 i oppsigelse av transkripsjon av RNA polymerase II ble demonstrert ved hjelp av tradisjonelle TRO analyse som oppdaget RNA i Terminator-proksimale delen av utvalgte gener 1. Påvisningen av RNA signal utover terminatorregion i den r...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach at JoVE.com

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.

Analyse av Opphør av transkripsjon Bruke BrUTP-strand-spesifikke transkripsjons Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transkripsjon Analyser og deres program i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analyse av Ambient Svevestøv-indusert kromosomavvik ved hjelp av en<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Analyse av c-KIT ligand-promotoren ved bruk av kromatinimmunutfelling

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

En roman metning mutagenese tilnærming: Enkeltsteg karakteristikk av regulatoriske Protein bindende områder i RNA bruker Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Omvendt transkripsjon-Loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) analysen for Zika Virus og Housekeeping gener i urin, Serum og mygg prøver

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bestemme 3-Termini og sekvenser av begynnende Single-strandet virus-DNA molekyler i HIV-1 reversere transkripsjon i infiserte celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

Bestemme sannsynligheten for Variant virusets aminosyre nivå Signal-til-støy analyse av genetisk variasjon

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...