Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

نشكر D. روديرر ل تزويدنا TcdA1 ميكروغرافس. نشكر ستيف لودتك على دعمه المستمر للبنية التحتية EMAN2. وأيد هذا العمل أموال من جمعية ماكس بلانك (إلى ريال) والمجلس الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7 / 2007-2013) (منحة رقم 615984) (إلى ريال) ومنحة من المعاهد الوطنية الصحة R01 GM60635 إلى باب).

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

وقد أظهرت الجسيمات واحد البرد- إم التطور السريع في السنوات الأخيرة، وسلمت العديد من هياكل القرار الذرية من المجمعات الجزيئية ذات الأهمية البيولوجية الكبرى 25 . من أجل دعم عدد كبير من المستخدمين المبتدئين الذين يدخلون حاليا الحقل، قمنا بتطوير منصة تحليل صورة الجسيمات واحد سفير وتقديم هنا من خلال بروتوكول المشي من خلال سير العمل بأكمله بما في ذلك محاذاة الفيلم، واختيار الجسيمات، تقدير كتف، النموذج الأولي حساب، 2D و 3D تحليل عدم التجانس، عالية الدقة 3D صقل وتقدير القرار المحلي والتصفية. ويهدف البروتوكول الموصوفة هنا كدليل قصير لتحديد هيكل 3D باستخدام ميكروغرافس البرد إم من البروتين من الفائدة وبمساعدة من الأدوات الحسابية التي تقدمها واجهة المستخدم الرسومية المستقلة من سفير. السمة الرئيسية لسير العمل هو أن معظممن الإجراءات تحتاج إلى تشغيل مرة واحدة فقط، لأنها تعتمد على مفهوم التحقق من صحة من قبل استنساخ 19 ولا تتطلب المعلمة التغيير والتبديل. هذه الآلية التلقائية للتحقق من الصحة هي الميزة الرئيسية ل سفير على حزم البرامج الأخرى منذ النتائج تميل إلى أن تكون موضوعية وكذلك استنساخه، والأهم من ذلك، يمكن الحصول عليها بتكلفة حسابية مقبولة. ويوفر خط الأنابيب بالإضافة إلى ذلك ثروة من المعلومات التشخيصية للمستخدمين ذوي الخبرة لإجراء مزيد من التحقق المستقل والتقييم مع الأساليب الخاصة. ومع ذلك، يجب أن يكون المستخدم المبتدئ الذي لديه على الأقل الخلفية النظرية عنصري في علم الأحياء الهيكلي والمجهر الإلكتروني قادرة على الحصول على هياكل قرار شبه الذرية باستخدام البيانات الخاصة وإجراءات التحقق الآلي. ومع ذلك، فإن الحصول على بنية قرار شبه الذرية ليست دائما واضحة وسوف تعتمد النتيجة إلى حد كبير على نوعية العينة ودات المدخلاتا. وفيما يتعلق بالإجراءات المعروضة هنا، يفترض أن عددا كافيا من أفلام إم الخام غير المحاذاة عالية الجودة متوافرة، مع أن متوسطاتها تظهر جسيمات مفردة متجانسة ومميزة بشكل عشوائي. بشكل عام، لا توجد قيود على التماثل أو الحجم أو الشكل العام للجزيء، ولكن الوزن الجزيئي المنخفض يمكن أن يكون عاملا محددا، خاصة عندما يكون للبروتين شكل كروي بدون سمات. وعادة ما يكون تحليل الجسيمات الأكبر حجما والمرتبة جيدا مع التماثل العالي بين النقاط أقل تطلبا. ولذلك، فمن المستحسن للمستخدمين المبتدئين لتشغيل البروتوكول الحالي لأول مرة مع مجموعة بيانات كريو-إم جيدا. إما البيانات التعليمية سفير (هتب: /sphire.mpg.de) أو واحدة من إمبيار مجموعات البيانات المقدمة (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) مع الأفلام الخام هي نقطة انطلاق جيدة . عند معالجة البيانات الخاصة، فمن المرجح جدا أن بعض مجموعات البيانات أو بعض الصور لن يرضي بعض كواليتي. في هذا السياق، بالإضافة إلى الشيكات الاستقرار الآلي والتكاثر، التي يؤديها البرنامج للخطوات الرئيسية لسير العمل، فإنه لا يزال يوصي للمستخدمين لفحص بصريا النتائج في بعض &quot;نقاط التفتيش&quot; من البروتوكول، وخاصة إذا كان إعادة الإعمار النهائي ليست مرضية. يمكن إجراء الفحص البصري الأول على مستوى ميكروغراف بعد محاذاة الفيلم ( بروتوكول الخطوة 2 ) وتقدير كتف ( بروتوكول الخطوة 3 ). وينبغي أن تظهر المعدلات المصححة الناتجة عن الحركة جسيمات مفردة واضحة المعالم وذات فصل جيد، وينبغي أن تظهر أطياف الطاقة الخاصة بها حلقات ثون واضحة ومتنوعة. ويعرف التردد المكاني الذي تكون فيه مرئية، في معظم الحالات، أعلى درجة يمكن أن يحددها الهيكل من حيث المبدأ في نهاية المطاف. وترد أمثلة لمتوسط ​​تصحيح الحركة من نوعية كافية وطيف الطاقة في القسم &amp; #34؛ نتائج الممثل &quot;، ويمكن إزالة الصور الخارجة التي قد يكون لها تأثير سلبي على النتيجة النهائية بمساعدة سفير الانجراف و كتف تقييم أدوات واجهة المستخدم الرسومية (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). وفيما يتعلق بفحص الجسيمات، فإن الخطوة الحاسمة في خط أنابيب سفير هي التصنيف 2D باستخدام إيساك ( بروتوكول الخطوة 5.2) . هنا، يجب على المستخدم التحكم في أن المتوسطات الطبقة 2D استنساخه التي يتم تحديدها تلقائيا من قبل البرنامج تعتمد مجموعة من التوجهات كافية لتغطية شبه بالتساوي الفضاء الزاوي. إذا كانت جودة المتوسطات الصفية غير مرضية (صاخبة و / أو صور ضبابية) و / أو عدد متوسطات الطبقة القابلة للتكرار منخفضة جدا، فكر في تحسين جودة التقاط السيارات، وتحسين تصوير مجموعة البيانات أو إعداد العينات. في معظم الحالات، لا يمكن حساب إعادة بناء موثوق بها من مجموعة بيانات لا تعطي متوسطات جيدة للصف الثاني. أمثلة على جودة عالية 2D الطبقة أفيتظهر في القسم &quot;نتائج الممثل&quot;. مطلوب ما لا يقل عن 100 المتوسطات الطبقة للحصول على نموذج 3D الأولي موثوق بها باستخدام رفيبر بطريقة تلقائية ( بروتوكول الخطوة 6.1 ). لهذه الخطوة، يجب على المستخدم تحديد المتوسطات بأعلى مستويات الجودة وتشمل العديد من التوجهات المختلفة للجسيمات ممكن. جودة النموذج الأولي أمر بالغ الأهمية لنجاح اللاحقة عالية الدقة 3D صقل. في حزم البرمجيات الأخرى، يتم تنفيذ تصنيف 3D أحيانا لإزالة جزيئات &quot;سيئة&quot; 8 ، 9 . ومع ذلك، في سفير معظم هذه الجسيمات تلقائيا القضاء بالفعل خلال تصنيف 2D باستخدام إيساك. وبالتالي، فمن المستحسن لأداء خطوة مكثفة حسابيا من 3D الفرز إلا إذا كان إعادة الإعمار وتحليل التباين 3D تشير إلى عدم التجانس من مجموعة البيانات. الأهم من ذلك، يجب على المستخدم دائما فحص بعناية أحجام 3D الناتجة بعناية ( بروتوكول الخطوة 9.3 )، وتؤكد أن ملامح كثافة منها تتفق بشكل جيد مع القرار الاسمي. في قرار من &lt;9 Å، وكثافات تشبه قضيب المقابلة α-هيليسس تصبح مرئية. في قرار &lt;4.5 Å، الكثافات المقابلة للخيوط في β-صحائف عادة ما تكون منفصلة بشكل جيد والأحماض الأمينية ضخمة تصبح مرئية. يجب أن تظهر خريطة عالية الدقة (&lt;3 Å) سلاسل جانبية واضحة المعالم، مما يسمح ببناء نموذج ذري دقيق. النتائج التي تم الحصول عليها حتى الآن تبين أنه، بمساعدة الاختبارات استنساخ الآلي سفير والحد الأدنى من عمليات التفتيش البصرية، والبروتوكول الحالي ينطبق عموما على أي نوع من الجسيمات واحد مشروع البرد إم. يتم عرض نتائج ممثل كل خطوة معالجة لإعادة إعمار TCDA1 السمفوتورهابدوس لومينزنس 21 ، والتي تم حلها إلى قرار شبه الذرية. ويمكن استخدام خرائط الكثافة ذات النوعية المتشابهة لبناء نماذج ذرية موثوقة من خلال تعقب العمود الفقري دي نوفو ، فضلا عن الصقل المتبادل أو الفضاء الحقيقي، وبالتالي توفير إطار هيكلي متين لفهم الآليات الجزيئية المعقدة. أكسيون كوديس: الإحداثيات لهيكل إم والأفلام غير المجهزة قد أودعت في البنك بيانات المجهر الإلكتروني والميكروسكوب التجريبي صورة أرشيف تحت أرقام الانضمام إمد-3645 و إمبيار-10089، على التوالي.

بعد تطوير التكنولوجيا الكاشف الإلكترون المباشر، والتقدم الملحوظ في الجسيمات واحد كريو-إم حاليا إعادة تشكيل البيولوجيا الهيكلية 1 . وبالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية، تتطلب هذه التقنية كمية صغيرة فقط من مادة البروتين دون الحاجة إلى التبلور، بينما تفرض في الوقت نفسه قيودا أقل فيما يتعلق بنقاء العينة، ولا تزال تسمح بتحديد الهياكل عند الحل شبه الذري. الأهم من ذلك، يمكن أن تكون تركيبات أو ولايات مختلفة الآن مفصولة حسابيا ويمكن تحديد هيكلية من مختلف التوافقات على مستوى غير مسبوق من التفاصيل. في الآونة الأخيرة، يمكن أن تنتج خرائط الكثافة من الجزيئات الصعبة في القرارات التي تسمح دي نوفو بناء نموذج، وبالتالي فهم عميق من طريقة عملها 2 ، 3 ، 4 ، 5. تتوفر مجموعة واسعة من حزم برامج معالجة الصور في مجتمع 3DEM (3D إليكترون ميكروسكوبي) (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ومعظمها قيد التطوير المستمر. وقد تم التوصل إلى قرار شبه الذرية للبروتينات التي تظهر الأوزان الجزيئية المختلفة والتناظر مع العديد من حزم البرامج المختلفة، بما في ذلك EMAN2 6 ، إيماجيك 7 ، فريلين 8 ، ريليون 9 ، سبايدر 10 ، و سباركس 11 . وتتطلب كل حزمة مستوى مختلفا من خبرات المستعملين وتوفر مستوى مختلفا من توجيهات المستعملين والأتمتة والتمدد. وعلاوة على ذلك، في حين أن بعض البرامج توفر بيئات كاملة لتسهيل جميع خطوات تحليل الصور، فإن بعضها الآخر يهدف إلى تحسين المهام المحددة، مثل صقل معلمات المحاذاة بدءا من r المعروفةهيكل الإيجارات. وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير العديد من المنصات، بما في ذلك أبيون 12 و سسيبيون 13 ، التي توفر خط أنابيب معالجة واحد يدمج النهج والبروتوكولات من حزم البرامج المختلفة المذكورة أعلاه. للمساهمة في التنمية الحالية من البرد إم، تم إعادة تطوير سباركس إلى منصة مستقلة جديدة وكاملة لتحليل الجسيمات واحد، ودعا سفير (سباركس للمجهر الإلكتروني عالية الدقة). من أجل زيادة إمكانية الوصول إلى هذه التقنية للباحثين الجدد في هذا المجال، ومعالجة كمية كبيرة من البيانات التي تنتجها المجاهر الإلكترونية الحديثة بالكامل الآلي الآلي، وإعادة تصميم خط الأنابيب وتبسيطها من خلال تقديم وسيلة سهلة الاستخدام واجهة المستخدم الرسومية (غوي) وأتمتة الخطوات الرئيسية لسير العمل. وعلاوة على ذلك، تم إضافة خوارزميات جديدة للسماح سريع، استنساخه وتحديد الآلية الآلي من كريو-إم الصور. وعلاوة على ذلك، تم إدخال التحقق من قبل استنساخه من أجل تجنب القطع الأثرية المشتركة المنتجة خلال تحسين والتحليل عدم التجانس. وعلى الرغم من أن البرنامج قد تم تعديله على نطاق واسع، فقد تم الإبقاء على سماته الأساسية المقدرة: شفرة المصدر المفتوح المباشرة، والتصميم الحديث الموجه نحو الأشياء، واجهات بايثون لجميع الوظائف الأساسية. وبالتالي، لم يتغير إلى برنامج الصندوق الأسود، مما يتيح للمستخدمين دراسة وسهولة تعديل رمز بايثون، لإنشاء تطبيقات إضافية أو تعديل سير العمل العام. وهذا مفيد بشكل خاص للمشاريع غير القياسية البرد إم. هنا نقدم بروتوكول للحصول على خريطة كثافة القرار الذري القريب من الصور البرد إم باستخدام واجهة المستخدم الرسومية من سفير. وهو يصف بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لتوليد خريطة الكثافة من الخام البرد إم الأفلام كاشف المباشر ولا يقتصر على أي نوع جزيء معين. ويهدف هذا البروتوكول في المقام الأول لتوجيه نيوكيخدش في الميدان من خلال سير العمل وتقديم معلومات هامة حول الخطوات الحاسمة من تجهيز فضلا عن بعض المزالق والعقبات المحتملة. وسيتم وصف المزيد من الميزات المتقدمة والخلفية النظرية وراء سفير في مكان آخر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

سفير (سباركس للالمجهر الإلكتروني عالية الدقة) هو رواية مفتوحة المصدر، مجموعة برامج سهلة الاستعمال لمعالجة شبه الآلي من الجسيمات الإلكترونية واحدة البرد المجهري (البرد إم) البيانات. بروتوكول المعروضة هنا يصف بالتفصيل كيفية الحصول على بنية قرار شبه الذرية بدءا من البرد ميك الصور المجهرية من خلال توجيه المستخدمين من خلال جميع الخطوات من خط أنابيب تحديد هيكل الجسيم واحد. يتم التحكم في هذه الخطوات من واجهة المستخدم الرسومية سفير الجديدة وتتطلب الحد الأدنى من تدخل المستخدم. باستخدام هذا البروتوكول ، وقد استمدت بنية Å 3.5 من TcdA1، مجمع تكس تس من لومينزنس فوتورهابدوس ، فقط من 9500 جزيئات واحدة. وهذا النهج مبسطة تساعد المستخدمين المبتدئين دون خبرة معالجة واسعة ومعلومات هيكلية مسبقة ، للحصول على نماذج ذرية خالية من الضوضاء وغير متحيز من المجمعات الجزيئات المنقى في حالتهم الأصلية.

<html> تم تنفيذ البروتوكول الموصوف أعلاه بدءا من 112 أفلام الكشف المباشر للمكون A من فوتورهابدوس لومينزنس تك مجمع (TcdA1) 20 ، 21 ، 22 . تم تسجيل مجموعة البيانات هذه على المجهر الإلكتروني المجهز بالكرومونات المجهزة بطبقة عالية من السطوع (شفيغ)، والتي تعمل بجهد تسارع 300 ك.ف. تم الحصول على الصور تلقائيا مع جرعة إجمالية قدرها 60 ه - / Å -2 في حجم بكسل 1.14 Å على مقياس العينة. بعد محاذاة إطارات الفيلم ( بروتوكول الخطوة 2 )، كان المتوسطات تصحيح الحركة الناتجة الخواص ثون خواتم تمتد إلى عالية الدقة ( الشكل 2A ). الجسيمات الفردية كانت مرئية بسهولة وفصلها جيدا ( الشكل 2B ). ثم تم اختيار الجسيمات باستخدام أداة سرب من e2boxerلاس = &quot;كريف&quot;&gt; 18 ( بروتوكول الخطوة 4.1 ). في هذه الحالة، تم تعيين عتبة مناسبة باستخدام الخيار أكثر انتقائية ( الشكل 2C ). وقد أسفرت المجهرية الرقمية 112 عن 9652 جسيمات. غالبية الصور المستخرجة ( بروتوكول الخطوة 4.2 ) تحتوي على جسيمات محددة جيدا وحجمها مربع ~ 1.5 مرات أكبر من حجم الجسيمات، على النحو الموصى به ( الشكل 2D ). بعد ذلك، باستخدام إيساك، تم إجراء تحليل عدم التجانس 2D ( بروتوكول الخطوة 5 ). أنها حققت 98 متوسطات الطبقة ( الشكل 3A ). باستخدام هذه المتوسطات الطبقة 2D، تم حساب نموذج أب الأول باستخدام فيبر ( بروتوكول الخطوة 6 ) في قرار وسيطة ( الشكل 3B ). هذا النموذج يظهر اتفاق ممتاز مع هيكل الكريستال TCDA1 حلها سابقا في 3.9 Å قرار 22 ( الشكل 3C ). وقد تم استخدام هذا النموذج الأولي كقالب أولي<html> (ميريديان)، مما أسفر عن إعادة إعمار 3.5 Å (0.143 معيار) ( بروتوكول الخطوة 7 ) من وحدات فقط غير المتناظرة ~ 40،000 ( الشكل 4 ). تم الحصول على هذه الخريطة قرار شبه الذرية في غضون 24 ساعة، وذلك باستخدام ما يصل إلى 96 وحدة المعالجة المركزية لخطوات سير العمل التي تستفيد من النوى متعددة. وبالنسبة لتحليل التباين الثلاثي الأبعاد (بروتوكول الخطوة 8)، لم يستخدم سوى 2000 صورة جزئية لكل مجموعة في الخطوة 8.3.3 ( أي تبدأ العملية ب 5 مجموعات ثلاثية الأبعاد أولية) و 200 صورة لأصغر حجم للمجموعة في الخطوة 8.3.4 بسبب وعدد قليل من الجسيمات (~ 10،000). كشف التحليل المرونة المحلية أساسا في المنطقة N- محطة من المجمع الذي يحتوي على علامته المستخدمة لتنقية ( الشكل 5A ). في الواقع، لم يتم حل اثني عشر بقايا N- محطة والعلامة له في هيكل الكريستال المنشورة سابقا من TCDA1&quot;&gt; 22 وظلت هذه المنطقة الأكثر اختلالا دون حل في الكثافة الحالية البرد إم، ويرجع ذلك على الأرجح إلى مرونتها.وقد تم الكشف عن التباين إضافية في المجالات ملزمة مستقبلات ومجال بك ملزمة ( الشكل 5A ) وقرار مرضي للهيكل وحجم صغير نوعا ما من مجموعة البيانات، وقد تقرر هذا التغاير أن تكون مقبولة، وبالتالي لم يتم تنفيذ تصنيف 3D تركز 23. وأخيرا، تم حساب القرار المحلي لخريطة الكثافة النهائية ( بروتوكول الخطوة 9.1، الشكل 5 ب ) وتم ترشيح خريطة 3D شحذ محليا ( بروتوكول الخطوة 9.2) ويمكن استخدام حجم من هذه النوعية لبناء نموذج نوفو باستخدام كوت 24 أو أي أداة أخرى صقل ( الشكل 6 ). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;سترونغ&gt; الشكل 1: معالجة الصور باستخدام سفير. ( أ ) واجهة المستخدم الرسومية لحزمة برمجيات سفير. يمكن تنشيط خطوة معينة من سير العمل من خلال تحديد الرسم التوضيحي الخاص به على الجانب الأيسر من واجهة المستخدم الرسومية (&quot;خطوة سير العمل&quot;). ستظهر الأوامر والمرافق المرتبطة بهذه الخطوة من سير العمل في المنطقة المركزية من واجهة المستخدم الرسومية. بعد اختيار أحد الأوامر، يتم عرض المعلمات ذات الصلة على المنطقة اليمنى من واجهة المستخدم الرسومية. عادة لا تتطلب المعلمات المتقدمة تعديل القيم الافتراضية المحددة مسبقا. ( ب ) المراحل في سير العمل لمعالجة صورة الجسيمات المفردة باستخدام واجهة المستخدم الرسومية سفير. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> الشكل 2: تصحيح الحركة والخاصةلي استخراج. ( أ ، ب ) نموذجية عالية الجودة، جرعة منخفضة، المجهرية الرقمية الانجراف تصحيحها سجلت في تباطؤ 1.7 ميكرون. لاحظ حلقات ثون متناحية يمتد إلى قرار من 2.7 Å في الطيف السلطة (أ) والجسيمات واضحة جيدا في صورة 2D ( ب ). ( ج ) اختيار الجسيمات باستخدام e2boxer. الدوائر الخضراء تشير إلى الجسيمات المختارة. ( د ) الجسيمات الخام النموذجية المستخرجة من الجسيمات المجهرية المرجحة بالجرعة. مقياس الحانات = 20 نانومتر. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> الشكل 3: تجميع ثنائي الأبعاد وتوليد النموذج الأولي. ( أ ) معرض متوسطات الصف الثانى، حيث تمثل الأغلبية وجهات نظر جانبية o<html> f الجسيمات. مقياس شريط = 20 نانومتر. ( ب ) أب أول خريطة 3D TCDA1 الحصول عليها باستخدام رفيبر من المتوسطات فئة خالية من المرجعية. ( ج ) تركيب الجسم الصلب للهيكل البلوري TCDA1 (أشرطة) (بدب-إد 1VW1) في كثافة البرد-إم الأولية (رمادي شفاف). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> الشكل 4: كريو-إم 3D هيكل TCDA1. ( أ ، ب ) النهائي 3.5 Å كثافة خريطة TCDA1 محسوبة باستخدام ~ 9،500 صور الجسيمات: ( أ ) الجانب و ( ب ) أعلى عرض. ( ج ) المناطق التمثيلية للكثافة إم البرد ل α الحلزون و β ورقة.arge.jpg &quot;تارجيت =&quot; _ بلانك &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> الشكل 5: تحليل التباين والقرار المحلي. ( أ ) سطح خريطة TryA1 كريو-إم شحذ (الرمادي) وخريطة التباين (الأخضر). للحصول على وضوح أفضل، كانت خريطة التباين منخفضة تمرير تصفيتها إلى 30 Å. ( ب ) تقديم السطح من TCDA1 شحذ خريطة كريو-إم الملونة وفقا للقرار المحلي (Å). لاحظ الاتفاق الطوبولوجي بين المناطق ذات التباين العالي وانخفاض القرار المحلي. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> الشكل 6: وزارة الدفاع 3Dبناء TCDA1 باستخدام كوت. يتم عرض المناطق التمثيلية للكثافة إم البرد والنموذج الذري ل α الحلزون. تم بناء النموذج الذري دي نوفو باستخدام كوت. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

تقدم هذه الورقة بروتوكول لمعالجة الصور البرد إم باستخدام مجموعة البرامج سفير. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على ما يقرب من جميع المشاريع إم الجسيمات واحد التي تستهدف قرار شبه الذرية.

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

التنميط العالي الاستبانة بواسطة Cryoslicing BN-MS التحليل

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM وتحليل الجسيمات المفردة مع Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

دليل لطخة والغطس تجميد العينات البيولوجية للجسيمات المفردة المجهر الإلكترون المبردة

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

تطوير التصوير عالي الدقة لتجميعات الفيروسات في السائل والجليد

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...