Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

Vi takker D. Roderer for at give os TcdA1 mikrografier. Vi takker Steve Ludtke for hans løbende støtte til EMAN2-infrastrukturen. Dette arbejde blev støttet af midler fra Max Planck Society (til SR) og Det Europæiske Råd under EU&#39;s syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) (tilskud nr. 615984) (til SR) og tilskud fra National Institutes of Sundhed R01 GM60635 til PAP).

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Enkeltpartikelkryo-EM har vist en hurtig udvikling i de seneste år og leveret talrige atomopløsningsstrukturer af makromolekylære komplekser med stor biologisk betydning 25 . For at understøtte det store antal nybegyndere, der aktuelt kommer ind i feltet, udviklede vi single-particle image analyse platformen SPHIRE og præsenterer her en gennemgangsprotokol for hele workflowen herunder filmjustering, partikelplukning, CTF estimering, indledende model Beregning, 2D og 3D heterogenitetsanalyse, høj opløsning 3D raffinement og lokal opløsning estimering og filtrering. Den her beskrevne protokol er beregnet som en kort vejledning til 3D-strukturbestemmelse ved anvendelse af cryo-EM mikrografer af proteinet af interesse og ved hjælp af beregningsværktøjer tilvejebragt af SPHIRE&#39;s stand-alone GUI. Hovedtræk i arbejdsgangen er det mestAf procedurerne skal kun køres én gang, da de er afhængige af begrebet validering ved reproducerbarhed 19 og ikke kræver parameterjustering. Denne automatiske valideringsmekanisme er en hovedfordel ved SPHIRE over andre softwarepakker, da resultaterne er tilbøjelige til at være objektive såvel som reproducerbare og vigtigst af alt opnåelige til en acceptabel beregningskostnad. Rørledningen giver desuden et væld af diagnostiske oplysninger for erfarne brugere at foretage yderligere uafhængig validering og vurdering med egne metoder. Ikke desto mindre skal en nybegynder bruger, der har mindst elementær teoretisk baggrund i strukturbiologi og elektronmikroskopi, kunne opnå strukturer med nær atomopløsning ved brug af egne data og de automatiske valideringsprocedurer. At opnå en nær-atomopløsningsstruktur er imidlertid ikke altid ligetil, og resultatet vil højst afhænge af kvaliteten af ​​prøven og input-dataen. For de procedurer, der præsenteres her, antages det, at der er til rådighed et tilstrækkeligt antal ukorrekte råmiljøer af høj kvalitet, med deres gennemsnit, der viser klart synlige homogene og tilfældigt orienterede enkeltpartikler. Generelt er der ingen begrænsninger med hensyn til symmetri, størrelse eller overordnet form af molekylet, men en lavmolekylær vægt kan være en begrænsende faktor, især når proteinet har en featurløs kugleform. Normalt er analyse af større, velordnede partikler med højpunkts-gruppesymmetri mindre krævende. Derfor anbefales det kraftigt for nybegyndere at køre den nuværende protokol først med et velkendetegnet cryo-EM datasæt. Enten SPHIRE-tutorial-dataene (http: /sphire.mpg.de) eller et af EMPIAR-indsendte datasæt (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) med råfilm er et godt udgangspunkt . Ved behandling af egne data er det meget sandsynligt, at nogle datasæt eller nogle af billederne ikke vil tilfredsstille visse kvalifikationerTy kriterier. I denne sammenhæng ud over den automatiske stabilitet og reproducerbarhedskontrol, der udføres af programmet til større trin i arbejdsgangen, anbefales det stadig for brugerne at visuelt inspicere resultaterne ved visse &quot;kontrolpunkter&quot; i protokollen, især hvis den endelige rekonstruktion Er ikke tilfredsstillende. Den første visuelle inspektion kan udføres på mikrografniveau efter filmjusteringen ( protokol trin 2 ) og CTF estimationen ( protokol trin 3 ). De resulterende bevægelseskorrigerede middelværdier bør vise klart synlige og velafskilte enkeltpartikler, og deres effektspektre skal vise klart synlige, isotrope Thon-ringe. Den rumlige frekvens, som de er synlige, definerer i de fleste tilfælde den højeste opløsning, som strukturen i princippet i sidste ende kan bestemmes af. Eksempler på et bevægelseskorrigeret gennemsnit af tilstrækkelig kvalitet og dens effektspektrum er vist i afsnittet &amp; #34; Repræsentative resultater. &quot;Outlier-billeder, der kan have en negativ indvirkning på det endelige resultat, kan fjernes ved hjælp af SPHIREs GUI-værktøjer til drift og CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). Med hensyn til partikel screening er det afgørende trin i SPHIRE-rørledningen 2D-klassifikationen ved brug af ISAC ( protokol trin 5.2) . Her skal brugeren kontrollere, at de reproducerbare 2D-klassemiddeldata identificeres automatisk ved hjælp af programmet, idet der vedtages en række orienteringer, der er tilstrækkelige til at dække vinkelrummet på lige fod. Hvis kvaliteten af ​​klassens gennemsnit ikke er tilfredsstillende (støjende og / eller uskarpe billeder) og / eller antallet af reproducerbare klasse gennemsnit er meget lavt, overveje at forbedre automatisk plukningskvalitet, optimere datasæt billeddannelse eller prøve forberedelse. I de fleste tilfælde er det ikke muligt at beregne en pålidelig rekonstruktion fra et datasæt, der ikke giver gode 2D klasse gennemsnit. Eksempler på høj kvalitet 2D klasse aveRaser vises i afsnittet &quot;repræsentative resultater&quot;. Mindst 100 klasse gennemsnit er påkrævet for at opnå en pålidelig indledende 3D model ved hjælp af RVIPER på en automatiseret måde ( Protokol trin 6.1 ). For dette trin skal brugeren vælge gennemsnitene med højeste kvalitet og inddrage så mange forskellige orienteringer af partiklen som muligt. Kvaliteten af ​​den oprindelige model er afgørende for succesen med den efterfølgende højopløsnings 3D-raffinement. I andre softwarepakker udføres der undertiden 3D-klassificering for at fjerne &quot;dårlige&quot; partikler 8 , 9 . I SPHIRE elimineres de fleste af disse partikler automatisk allerede under 2D-klassificering ved brug af ISAC. Det anbefales derfor at udføre det beregningsintensive trin med 3D sortering, hvis rekonstruktionen og 3D variabilitetsanalysen angiver datasætets heterogenitet. Vigtigst bør brugeren omhyggeligt inspicere de resulterende 3D-mængder omhyggeligt ( protokol trin 9.3 ) og bekræfte, at funktionerne i den pågældende densitet stemmer overens med den nominelle opløsning. Ved en opløsning på &lt;9 Å bliver stanglignende densiteter svarende til a-helixer synlige. Ved en opløsning &lt;4.5 Å er densiteter svarende til tråde i β-ark normalt godt adskilte og omfangsrige aminosyrer bliver synlige. Et kort med høj opløsning (&lt;3 Å) skal vise tydelige sporbare sidekæder, hvilket gør det muligt at opbygge en nøjagtig atommodel. Resultater opnået til dato viser, at den foreliggende protokol ved anvendelse af SPHIREs automatiske reproducerbarhedsprøver og minimal visuelle inspektioner generelt er anvendelig for enhver type enkeltpartikel-cryo-EM-projekt. Repræsentative resultater af hvert behandlingstrin vises for rekonstruktionen af ​​TcdA1-toksinet afPhotorhabdus luminescens 21 , som er blevet løst til nær-atomopløsning. Tæthedskort af tilsvarende kvalitet kan bruges til at konstruere pålidelige atommodeller ved hjælp af de novo backbone-sporing samt gensidig eller reel rumforfining og således tilvejebringe en solid strukturel ramme for forståelsen af ​​komplekse molekylære mekanismer. ACCESSION CODES: Koordinaterne til EM-strukturen og de ubehandlede film er blevet deponeret i Electron Microscopy Data Bank og Electron Microscopy Pilot Image Archive under tiltrædelsesnummer EMD-3645 og EMPIAR-10089.

Efter udviklingen af ​​direkte elektrondetektorteknologien omformes de bemærkelsesværdige fremskridt i single particle cryo-EM i øjeblikket om strukturel biologi 1 . Sammenlignet med røntgenkrystallografi kræver denne teknik kun en lille mængde proteinmateriale uden behov for krystallisation, samtidig med at der stilles færre restriktioner for renhed af prøven og stadig tillader bestemmelse af strukturer ved næratomisk opløsning. Vigtigt kan forskellige sammensætninger eller tilstande nu beregnes adskilt, og strukturbestemmelsen af ​​de forskellige konformationer kan udføres ved hidtil uset detaljeringsniveau. For nylig kunne tæthedskort af udfordrende molekyler fremstilles ved opløsninger, der tillod de novo modelbygning og dermed en dyb forståelse af deres virkemåde 2 , 3 , 4 , 5. En bred vifte af billedbehandlingsprogrammer er tilgængelige i 3DEM (3D Electron Microscopy) -samfundet (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy), og de fleste af dem er under kontinuerlig udvikling. Næratomisk opløsning er opnået for proteiner, der udviser forskellige molekylvægte og symmetrier med flere forskellige softwarepakker, herunder EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 og SPARX 11 . Hver pakke kræver et andet niveau af brugerkompetence og giver et andet niveau af brugervejledning, automatisering og udvidelighed. Desuden, mens nogle programmer giver komplette miljøer til at lette alle trin i billedanalyse, er andre designet til at optimere specifikke opgaver, såsom forfining af justeringsparametre fra en kendt rEference struktur. For nylig er der udviklet flere platforme, herunder APPION 12 og SCIPION 13 , der giver en enkeltbehandlingsrørledning, der integrerer tilgange og protokoller fra de forskellige softwarepakker, der er anført ovenfor. For at bidrage til den nuværende udvikling af cryo-EM blev SPARX genudviklet til en ny stand-alone og komplet platform for enkeltpartikelanalyse, kaldet SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy). For at øge tilgængeligheden af ​​teknikken til nye forskere på området og at klare den store mængde data, der produceres af moderne fuldt automatiserede high-end elektronmikroskoper, blev behandlingsrørledningen redesignet og forenklet ved at indføre en nem at bruge Grafisk brugergrænseflade (GUI) og automatisering af de vigtigste trin i arbejdsgangen. Derudover blev nye algoritmer tilsat for at tillade hurtig, reproducerbar og automatiseret strukturbestemmelse fra crYo-EM billeder. Endvidere blev validering ved reproducerbarhed indført for at undgå almindelige artefakter produceret under raffinering og heterogenitetsanalyse. Selv om programmet blev ændret i vid udstrækning, blev dets værdsatte kerneegenskaber opretholdt: ligefrem åben kildekode, det moderne objektorienterede design og Python-grænseflader til alle grundlæggende funktioner. Således blev det ikke ændret til et sort box-program, der gør det muligt for brugerne at studere og nemt ændre Python-koden, for at oprette yderligere applikationer eller ændre den samlede arbejdsgang. Dette er især nyttigt for ikke-standardiserede cryo-EM projekter. Her præsenterer vi en protokol for at opnå et nær-atomisk opløsningstæthedskort fra cryo-EM-billeder ved hjælp af GUI fra SPHIRE. Det beskriver i detaljer alle trin, der kræves for at generere et tæthedskort fra rå cryo-EM direkte detektorfilm og er ikke begrænset til en bestemt makromolekyltype. Denne protokol har primært til hensigt at lede newcOmers i feltet gennem arbejdsgangen og give vigtige oplysninger om vigtige trin i behandlingen samt nogle af de mulige faldgruber og forhindringer. Mere avancerede funktioner og den teoretiske baggrund bag SPHIRE vil blive beskrevet andetsteds.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE (SPARX til højopløsningselektronmikroskopi) er en ny åben, brugervenlig softwarepakke til halvautomatisk behandling af enkeltpartikelelektronkryomikroskopi (cryo-EM) data. Protokollen, der præsenteres her, beskriver detaljeret, hvordan man opnår en nær-atomopløsningsstruktur startende fra cryo-EM mikrograph-film ved at lede brugerne gennem alle trin i den enkelte partikelstrukturbestemmelsesrørledning. Disse trin styres fra den nye grafiske brugergrænseflade SPHIRE og kræver minimal brugerintervention. Ved anvendelse af denne protokol blev en 3,5 Å struktur af TcdA1, et Tc toxinkompleks fra Photorhabdus luminescens , afledt af kun 9500 enkeltpartikler. Denne strømlinede tilgang vil hjælpe nybegyndere uden omfattende behandlingserfaring og a priori strukturelle oplysninger for at opnå støjfrie og upartiske atommodeller af deres oprensede makromolekylære komplekser i deres oprindelige tilstand.

<html> Protokollen beskrevet ovenfor blev udført ud fra 112 direkte detektorfilm fra A-komponenten af Photorhabdus luminescens Tc-komplekset (TcdA1) 20 , 21 , 22 . Dette datasæt blev optaget på et Cs-korrigeret elektronkryo-mikroskop med en højlysstyrkefeltemissionskanon (XFEG), der drives ved en accelerationsspænding på 300 kV. Billederne blev erhvervet automatisk med en samlet dosis på 60 e - / Å -2 ved en pixelstørrelse på 1,14 Å på prøve skalaen. Efter justering af filmrammerne ( Protokol Trin 2 ) havde de resulterende bevægelseskorrigerede middelværdier isotrope Thon-ringe, der strækker sig til høj opløsning ( figur 2a ). De enkelte partikler var let synlige og godt separerede ( figur 2b ). Partikler blev plukket ved anvendelse af sværktøjet af e2boxerLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( Protokol Trin 4.1 ). I dette tilfælde blev der fastsat en passende tærskel ved hjælp af den mere selektive indstilling ( figur 2c ). De 112 digitale mikrografer gav 9.652 partikler. Størstedelen af ​​de ekstraherede billeder ( Protokol Trin 4.2 ) indeholdt veldefinerede partikler, og deres kasse størrelse var ~ 1,5 gange større end partikelstørrelsen som anbefalet ( figur 2d ). Ved anvendelse af ISAC blev der derefter udført en 2D heterogenitetsanalyse ( Protokol Trin 5 ). Det gav 98 klasse gennemsnit ( figur 3a ). Ved hjælp af disse 2D klasse gennemsnit blev en ab initio model beregnet ved hjælp af VIPER ( Protocol Step 6 ) ved mellemliggende opløsning ( Figur 3b ). Denne model viser fremragende aftale med krystalstrukturen af ​​TcdA1, der tidligere er løst ved 3,9 Å opløsning 22 ( figur 3c ). Denne ab initio model blev brugt som en indledende tem<html> Plade til 3D-raffinement (MERIDIEN), der giver en 3,5 Å (0,143 kriterium) rekonstruktion ( Protokol Trin 7 ) fra kun ~ 40.000 asymmetriske enheder ( Figur 4 ). Dette kort over atomopløsning blev opnået inden for 24 timer, idet der blev brugt op til 96 CPU&#39;er til trinene i arbejdsgangen, der har gavn af flere kerner. Til 3D-variabilitetsanalysen ( protokolstrin 8) blev kun 2.000 partikelbilleder pr. Gruppe anvendt i trin 8.3.3 ( dvs. processen starter med 5 indledende 3D-grupper) og 200 billeder for den mindste gruppestørrelse i trin 8.3.4 på grund af Det lille antal partikler (~ 10.000). Analysen afslørede lokaliseret fleksibilitet hovedsageligt i det N-terminale område af komplekset, der indeholder His-mærket anvendt til oprensning ( Figur 5a ). Faktisk blev tolv N-terminale rester og His-mærket ikke løst i den tidligere offentliggjorte krystalstruktur af TcdA1&quot;&gt; 22 og denne sandsynligvis forstyrrede region forblev uopløst i den nuværende cryo-EM-densitet, sandsynligvis på grund af dens fleksibilitet. Yderligere variabilitet blev detekteret ved receptorbindende domæner og BC-bindingsdomænet ( Figur 5a ). Tilfredsstillende opbygning af strukturen og datasættets ret lille størrelse, blev denne heterogenitet besluttet at være tolerabel, og derfor blev en fokuseret 3D klassifikation 23 ikke udført. Endelig blev den lokale opløsning af slutdensitetskortet beregnet ( protokol trin 9.1, figur 5b ) og det skarpe 3D-kort blev lokalt filtreret ( protokol trin 9.2) . Et volumen af ​​denne kvalitet kan anvendes til de novo- modelbygning ved anvendelse af Coot 24 eller ethvert andet raffineringsværktøj ( figur 6 ). <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Strong&gt; Figur 1: Billedbehandling ved hjælp af SPHIRE. ( A ) GUI i SPHIRE softwarepakken. Et bestemt trin i workflow kan aktiveres ved at vælge det respektive piktogram på venstre side af GUI&#39;en (&quot;workflow-trin&quot;). Kommandoer og hjælpeprogrammer, der er knyttet til dette trin i arbejdsgangen, vises i det centrale område af GUI&#39;et. Efter at have valgt en af ​​kommandoerne, vises de respektive parametre i det højre område af GUI&#39;en. Avancerede parametre kræver normalt ikke ændring af de forudindstillede standardværdier. ( B ) Stages i arbejdsprocessen for enkeltpartikel billedbehandling ved hjælp af SPHIRE GUI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> Figur 2: Bevægelseskorrektion og partiskLe ekstraktion. ( A , b ) Typisk højkvalitets, lavdosis, drift-korrigeret digital mikrograf registreret ved en defokus på 1,7 μm. Bemærk, at de isotropiske Thon-ringe strækker sig til en opløsning på 2,7 Å i effektspektret (a) og de velkendte partikler i 2D-billedet ( b ). ( C ) Partikelvalg ved anvendelse af e2boxer. Grønne cirkler angiver udvalgte partikler. ( D ) Typiske råpartikler ekstraheret fra den dosisvægtede mikrograf. Skalestænger = 20 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> Figur 3: 2D Clustering og Initial Model Generation. ( A ) Galleri med 2D klasse gennemsnit, med de fleste repræsentative sidevisninger o<html> F partiklen. Skalbjælke = 20 nm. ( B ) Ab initio 3D-kort over TcdA1 opnået ved hjælp af RVIPER fra referencefrit klasse gennemsnit. ( C ) Kropsbygning af TcdA1-krystalstrukturen (bånd) (pdb-id 1VW1) i den oprindelige kryo-EM-tæthed (gennemsigtig grå). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> Figur 4: Cryo-EM 3D struktur af TcdA1. ( A , b ) Endelig 3,5 Å tæthedskort over TcdA1 beregnet ved brug af ~ 9.500 partikelbilleder: ( a ) side og ( b ) ovenfra. ( C ) Repræsentative områder af cryo-EM-densiteten for en a-helix og en β-ark.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Venligst klik her for at se en større version af denne figur. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> Figur 5: Variabilitetsanalyse og lokal opløsning. ( A ) Overflade af den skærpet TcdA1 cryo-EM-kort (grå) og variabilitetskortet (grønt). For bedre klarhed blev variabilitetskortet lavpasfiltreret til 30 Å. ( B ) Overfladegengivelse af TcdA1-skærpet cryo-EM-kort farvet i henhold til lokal opløsning (Å). Bemærk den topologiske aftale mellem områder med høj variabilitet og lav lokal opløsning. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> Figur 6: 3D ModEl Bygning af TcdA1 ved hjælp af Coot. Repræsentative regioner af cryo-EM-densiteten og atommodellen er vist for en a-helix. Atommodellen blev bygget de novo ved hjælp af Coot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Dette papir præsenterer en protokol til behandling af cryo-EM-billeder ved hjælp af softwarepakken SPHIRE. Den nuværende protokol kan anvendes til næsten alle enkeltpartikel-EM-projekter, der er rettet mod nær-atomopløsning.

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Complexome-profilering med høj opløsning ved Cryoslicing BN-MS-analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM og enkeltpartikelanalyse med Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse af lameller fra glasagtige biologiske prøver ved hjælp af et dobbeltstrålescanningselektronmikroskop til kryo-elektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi: Fra prøve til struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Manuel blot-og-plunge frysning af biologiske prøver til enkelt-partikel kryogen elektronmikroskopi

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

En robust arbejdsgang for behandling af kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med cryoSPARC, RELION og Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemæssig indsamling af kryo-EM-datasæt i høj opløsning ved hjælp af 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Fremme af højopløsningsbilleddannelse af virussamlinger i væske og is

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...