Name: high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

Wij danken D. Roderer voor het leveren van ons TcdA1 micrographs. We bedanken Steve Ludtke voor zijn lopende ondersteuning van EMAN2-infrastructuur. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de Max Planck Society (naar de SR) en de Europese Raad in het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (KP7 / 2007-2013) (subsidie ​​nr. 615984) (naar SR) en subsidie ​​van de nationale instituten van Gezondheid R01 GM60635 naar PAP).

<ol>
	<li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique.">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy.">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li><li>Bai, X. -. C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atomic+structure+of+human+&#947;-secretase.">An atomic structure of human &#947;-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li><li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution.">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li><li>von der Ecken, J., M&#252;ller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex.">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li><li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMAN2:+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy.">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li><li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system.">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li><li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FREALIGN:+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures.">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li><li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RELION:+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination.">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li><li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs.">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li><li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPARX,+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing.">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li><li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appion:+an+integrated,+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing.">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li><li>de la Rosa-Trev&#236;n, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+&#197;+reconstruction+of+rotavirus+VP6.">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 &#197; reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980 (2015).</li><li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UCSF+Chimera?A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis.">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li><li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment.">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).</li><li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SwarmPS:+rapid,+semi-automated+single+particle+selection+software.">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li><li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images.">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li><li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail.">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li><li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins.">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li><li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail.">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li><li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+focused+classification,+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis,+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation.">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).</li><li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+revolution+will+not+be+crystallized:+a+new+method+sweeps+through+structural+biology.">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Enkele deeltjescryo-EM heeft in de afgelopen jaren een snelle ontwikkeling getoond en leverde talrijke atoomresolutiestructuren van macromoleculaire complexen van grote biologische betekenis 25 op . Om het grote aantal beginnende gebruikers te ondersteunen die momenteel binnenkomen, ontwikkelden we het single-particle image- analyseplatform SPHIRE en presenteerde we hier een doorloopprotocol voor de gehele workflow inclusief filmuitlijning, deeltjespikken, CTF-schatting, eerste model Berekening, 2D en 3D heterogeniteitsanalyse, hoge resolutie 3D-verfijning en lokale resolutie schatting en filtering. Het hier beschreven protocol is bedoeld als een korte gids voor het bepalen van de 3D-structuur met behulp van cryo-EM micrographs van het geïnde eiwit en met behulp van computergereedschap die door de stand-alone GUI van SPHIRE wordt geleverd. Het belangrijkste kenmerk van de workflow is dat het meestVan de procedures moeten slechts één keer worden uitgevoerd, aangezien zij vertrouwen op het concept van validatie door reproduceerbaarheid 19 en geen parameter tweaking nodig hebben. Dit automatische validatiemechanisme is een voornaamste voordeel van SPHIRE over andere softwarepakketten, aangezien de resultaten zowel objectief als reproduceerbaar zijn, en vooral belangrijk zijn tegen aanvaardbare computerkosten. De pijpleiding biedt bovendien een schat aan diagnostische informatie voor ervaren gebruikers om zelfstandige validatie en beoordeling met eigen methoden te voeren. Desalniettemin moet een beginnende gebruiker die tenminste elementaire theoretische achtergrond heeft in structurele biologie en elektronenmicroscopie, in staat zijn om near-atomic resolution structuren te verkrijgen door gebruik te maken van eigen data en de geautomatiseerde validatieprocedures. Het verkrijgen van een near-atomische resolutie structuur is echter niet altijd eenvoudig en het resultaat zal sterk afhangen van de kwaliteit van het monster en de invoer dieeen. Voor de hier geplaatste procedures wordt ervan uitgegaan dat er voldoende voldoende ongewijzigde ruwe EM-films van hoge kwaliteit beschikbaar zijn, waarbij hun gemiddelden duidelijk duidelijke homogene en willekeurig georiënteerde enkele deeltjes aantonen. In het algemeen zijn er geen beperkingen met betrekking tot symmetrie, grootte of algemene vorm van het molecuul, maar een laag molecuulgewicht kan een beperkende factor zijn, vooral wanneer het eiwit een featurloze bolvormige vorm heeft. Meestal is analyseren van grotere, goed bestelde deeltjes met hoge punt-groepssymmetrie minder veeleisend. Daarom is het sterk aan te bevelen voor beginnende gebruikers om het huidige protocol eerst te runnen met een goed gekenmerkt cryo-EM dataset. Ofwel de SPHIRE-studiegegevens (http: /sphire.mpg.de) of een van de EMPIAR-ingediende datasets (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) met rauwe films zijn een goed beginpunt . Bij het verwerken van eigen gegevens is het zeer waarschijnlijk dat sommige datasets of sommige afbeeldingen niet aan bepaalde kwaliteiten zullen voldoenTy criteria. In aanvulling op de geautomatiseerde stabiliteits- en reproduceerbaarheidscontroles, uitgevoerd door het programma voor belangrijke stappen van de workflow, wordt het nog steeds aanbevolen voor gebruikers om de resultaten visueel te inspecteren bij bepaalde &quot;checkpoints&quot; van het protocol, vooral als de uiteindelijke reconstructie Is niet bevredigend. De eerste visuele inspectie kan op het micrograafniveau worden uitgevoerd na de filmuitlijning ( protocol stap 2 ) en de CTF-schatting ( protocol stap 3 ). De resulterende bewegingsgerichte gemiddelden zouden duidelijk herkenbare en gescheiden afzonderlijke deeltjes moeten tonen en hun krachtspektra zouden duidelijk herkenbare, isotrope Thon-ringen moeten tonen. De ruimtelijke frequentie waarop ze zichtbaar zijn, definieert in de meeste gevallen de hoogste resolutie waaraan de structuur in principe uiteindelijk kan worden bepaald. Voorbeelden van een bewegingsgeregeld gemiddelde van voldoende kwaliteit en zijn vermogensspectrum worden weergegeven in de sectie &amp; #34; Representatieve resultaten. &quot;Outlier beelden die een negatief effect kunnen hebben op het eindresultaat, kunnen worden verwijderd met behulp van SPHIRE&#39;s Drift en CTF assessment GUI tools (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). Met betrekking tot deeltjescreening is de cruciale stap in de SPHIRE-pijpleiding de 2D-classificatie met behulp van ISAC ( Protocol stap 5.2) . Hier dient de gebruiker te controleren dat de reproduceerbare 2D-klasgemiddelden automatisch door het programma worden geïdentificeerd, een reeks oriëntaties vaststellen die voldoende zijn om de hoekruimte gelijkmatig te bedekken. Als de kwaliteit van de klasgemiddelden niet bevredigend is (luidruchtige en / of wazige afbeeldingen) en / of het aantal reproduceerbare klassengemiddelden zeer laag is, overwegen om de automatische plukkwaliteit te verbeteren, datasetbeeldvorming of voorbeeldbereiding te optimaliseren. In de meeste gevallen is het niet mogelijk om een ​​betrouwbare reconstructie uit een dataset te berekenen die geen goede 2D-klasgemiddelden geeft. Voorbeelden van hoogwaardige 2D klasse aveWoedingen worden weergegeven in de sectie &quot;Representatieve resultaten&quot;. Tenminste 100 klassengemiddelden zijn vereist om een ​​betrouwbaar eerste 3D-model te verkrijgen met behulp van RVIPER op een geautomatiseerde manier ( Protocol stap 6.1 ). Voor deze stap moet de gebruiker de gemiddelden selecteren met de hoogste kwaliteit en zo veel mogelijk oriëntaties van het deeltje bevatten. De kwaliteit van het initiële model is cruciaal voor het succes van de daaropvolgende 3D-verfijning met hoge resolutie. In andere softwarepakketten wordt soms een 3D-classificatie uitgevoerd om &quot;slechte&quot; deeltjes 8 , 9 te verwijderen. In SPHIRE worden de meeste van deze deeltjes echter automatisch verwijderd tijdens de 2D-classificatie met behulp van ISAC. Het wordt daarom aanbevolen om de computationeel intensieve stap van 3D-sortering alleen uit te voeren als de reconstructie en de 3D-variabiliteitsanalyse heterogeniteit van de dataset aanduiden. Belangrijker nog, de gebruiker moet de resulterende 3D-volumes zorgvuldig altijd inspecteren ( Protocol stap 9.3 ) en bevestig dat de eigenschappen van de betreffende dichtheid goed overeenstemmen met de nominale resolutie. Bij een resolutie van &lt;9 Å worden staafvormige dichtheden die overeenkomen met a-helices zichtbaar. Bij een resolutie &lt;4,5 Å, zijn dichtheden die overeenkomen met strengen in β-bladen normaal gescheiden en worden omvangrijke aminozuren zichtbaar. Een kaart met hoge resolutie (&lt;3 Å) zou duidelijk herkenbare zijketens moeten tonen, waardoor een nauwkeurig atoommodel kan worden gebouwd. Tot op heden verkregen resultaten blijkt dat, met behulp van SPHIRE&#39;s geautomatiseerde reproduceerbaarheidstesten en minimale visuele inspecties, het onderhavige protocol algemeen toepasbaar is op elk type enkel-deeltjescryo-EM project. Representatieve resultaten van elke verwerkingsstap worden getoond voor de reconstructie van het TcdA1 toxine vanPhotorhabdus luminescens 21 , die is opgelost aan bijna atomaire resolutie. Dichtheidskaarten van vergelijkbare kwaliteit kunnen gebruikt worden om betrouwbare atoommodellen te ontwerpen door middel van de novo -ruggengraatopsporing, alsmede wederkerige of echte ruimteverfijning, en aldus een solide structurele kader voor het begrijpen van complexe moleculaire mechanismen. ACCESSIE CODES: De coördinaten voor de EM-structuur en de onbewerkte films zijn gedeponeerd in de Electron Microscopy Data Bank en het Electron Microscopy Pilot Image Archive onder toetredingsnummers EMD-3645 en EMPIAR-10089.

Na de ontwikkeling van de directe elektronen detector technologie, is de opmerkelijke vooruitgang in single-particle cryo-EM momenteel herstructurering van structurele biologie 1 . Vergeleken met röntgenkristallografie vereist deze techniek slechts een kleine hoeveelheid eiwitmateriaal zonder de noodzaak van kristallisatie, terwijl tegelijkertijd minder beperkingen voor de zuiverheid van het monster worden gesteld en nog steeds de bepaling van structuren bij bijna atoomresolutie mogelijk maakt. Het is belangrijk dat verschillende composities of toestanden nu computationally gescheiden zijn en structuurbepaling van de verschillende conformaties kan worden uitgevoerd op een ongekend detailniveau. Recentelijk kunnen dichtheidskaarten van uitdagende moleculen worden geproduceerd bij resoluties waardoor de novo modelbouw mogelijk is en zo diep inzicht in hun werkingswijze 2 , 3 , 4 , 5. Een grote verscheidenheid aan beeldverwerkingssoftwarepakketten zijn beschikbaar in de 3DEM (3D Electron Microscopy) gemeenschap (https://nl.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) en de meeste van hen zijn onder voortdurende ontwikkeling. Bijna atoomresolutie is bereikt voor eiwitten die verschillende moleculaire gewichten en symmetrieën vertonen met verschillende softwarepakketten, waaronder EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 en SPARX 11 . Elk pakket vereist een ander niveau van gebruikers expertise en biedt een ander niveau van gebruikersbegeleiding, automatisering en extensibility. Bovendien, terwijl sommige programma&#39;s complete omgevingen bieden om alle stappen van beeldanalyse te vergemakkelijken, zijn anderen ontworpen om specifieke taken te optimaliseren, zoals de verfijning van uitlijnparameters vanaf een bekende rEferentiestructuur. Meer recent zijn er verschillende platforms ontwikkeld, waaronder APPION 12 en SCIPION 13 , die een enkele verwerkingspijpleiding bieden die benaderingen en protocollen integreert uit de hierboven genoemde softwarepakketten. Om bij te dragen aan de huidige ontwikkeling van cryo-EM, werd SPARX opnieuw ontwikkeld tot een nieuw stand-alone en compleet platform voor single particle analysis, genaamd SPHIRE (SPARX voor High Resolution Electron Microscopy). Om de toegankelijkheid van de techniek voor nieuwe onderzoekers op het gebied te vergroten en om te gaan met de grote hoeveelheid data die wordt geproduceerd door moderne volledig geautomatiseerde high-end elektronenmicroscopen, werd de verwerkingspijplijn opnieuw ontworpen en vereenvoudigd door een makkelijk te gebruiken Grafische gebruikersinterface (GUI) en automatisering van de belangrijkste stappen van de workflow. Bovendien werden nieuwe algoritmen toegevoegd om snelle, reproduceerbare en geautomatiseerde structuurbepaling van cr mogelijk te makenYo-EM beelden. Voorts werd validatie door reproduceerbaarheid geïntroduceerd om voorkomende gangbare artefacten te voorkomen die geproduceerd werden tijdens verfijning en heterogeniteitsanalyse. Hoewel het programma uitgebreid werd aangepast, werden de gewaardeerde kernkenmerken gehandhaafd: eenvoudige open source code, het moderne objectgerichte ontwerp en Python-interfaces voor alle basisfuncties. Zo werd het niet veranderd in een black box programma, waarmee gebruikers de Python-code kunnen bestuderen en gemakkelijk wijzigen, aanvullende toepassingen kunnen maken of de algehele werkstroom kunnen wijzigen. Dit is vooral handig voor non-standaard cryo-EM projecten. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van een map met bijna atoomresolutie dichtheid van cryo-EM beelden met behulp van de GUI van SPHIRE. Het beschrijft in detail alle stappen die nodig zijn om een ​​dichtheidskaart te genereren van ruwe cryo-EM directe detectorfilms en is niet beperkt tot een bepaald macromolecule type. Dit protocol is voornamelijk bedoeld om newc te begeleidenOmers in het veld door de workflow en verstrekken belangrijke informatie over cruciale stappen van de verwerking evenals enkele mogelijke valkuilen en obstakels. Meer geavanceerde functies en de theoretische achtergrond achter SPHIRE worden elders beschreven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SPHIRE</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund&#160; and Houston Medical School, Houston, Texas&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">http://sphire.mpg.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:288px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Unblur</td>
			<td style="width:288px;">Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coot</td>
			<td style="width:288px;">MRC Laboratory of Molecular Biology,&#160; Cambridge</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMAN2</td>
			<td style="width:288px;">Baylor College of Medicine, Houston</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Computing Cluster with 1824 cores</td>
			<td style="width:288px;">Max Planck Institute of Molecular Physiology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Linux Cluster with 76&#160; nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TITAN KRIOS electron microscope&#160;</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>300 kV, Cs correction, XFEG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon II direct electron detector</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EPU (automated data acquisition software)</td>
			<td style="width:288px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.fei.com/software/epu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution single particle analysis from electron cryo-microscopy images using sphire

SPHIRE (SPARX voor High-Resolution Electron Microscopy) is een nieuwe open-source, gebruiksvriendelijke software suite voor de semi-geautomatiseerde verwerking van single-particle electron cryo-microscopie (cryo-EM) data. Het hier beschreven protocol beschrijft in detail hoe u een near-atom-resolutie-structuur kunt verkrijgen die begint met cryo-EM micrograph films door gebruikers te begeleiden door middel van alle stappen van de bepaling van de pijplijn met enkele deeltjesstructuur. Deze stappen worden gecontroleerd vanuit de nieuwe SPHIRE grafische gebruikersinterface en vereisen minimale gebruikersinterventie. Met behulp van dit protocol werd een 3,5 Å structuur van TcdA1, een Tc toxine complex van Photorhabdus luminescens , afgeleid van slechts 9500 enkele deeltjes. Deze gestroomlijnde aanpak zal beginnende gebruikers helpen zonder uitgebreide verwerkingservaring en voorafgaande structurele informatie om geluidsvrije en onpartijdige atoommodellen van hun gezuiverde macromoleculaire complexen in hun eigen staat te verkrijgen.

<html> Het hierboven beschreven protocol werd uitgevoerd vanaf 112 directe detectorfilms van de A-component van het Photorhabdus luminescens Tc complex (TcdA1) 20 , 21 , 22 . Deze dataset werd opgenomen op een Cs-gecorrigeerde elektronencryo-microscoop met een XFEG-veld met hoge lichtsterkte, bediend met een versnellingspanning van 300 kV. De beelden werden automatisch verkregen met een totale dosis van 60 e - / Å -2 bij een pixelgrootte van 1,14 Å op de monsterschaal. Na de uitlijning van de filmkaders ( Protocol Stap 2 ), hadden de resulterende bewegingsgerichte gemiddelden isotrope Thon-ringen die zich uitstrekken tot hoge resolutie ( Figuur 2a ). De afzonderlijke deeltjes waren gemakkelijk zichtbaar en goed gescheiden ( figuur 2b ). Partikels werden vervolgens geplukt met behulp van het zwermgereedschap van e2boxerLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( Protocol Stap 4.1 ). In dit geval werd een passende drempel ingesteld met behulp van de meer selectieve optie ( figuur 2c ). De 112 digitale micrografen leverden 9.652 deeltjes op. De meerderheid van de geëxtraheerde beelden ( Protocol Stap 4.2 ) bevatten goed gedefinieerde deeltjes en hun doosgrootte was ~ 1,5 keer groter dan de deeltjesgrootte, zoals aanbevolen ( Figuur 2d ). Vervolgens werd met behulp van ISAC een 2D heterogeniteitsanalyse uitgevoerd ( Protocol Stap 5 ). Het leverde 98 klassengemiddelden op ( figuur 3a ). Met behulp van deze 2D-klassengemiddelden werd een ab initio- model berekend met behulp van VIPER ( Protocol Stap 6 ) bij intermediaire resolutie ( Figuur 3b ). Dit model laat een uitstekende overeenkomst zien met de kristalstructuur van TcdA1 die eerder is opgelost bij 3.9 Å resolutie 22 ( Figuur 3c ). Dit ab initio model werd gebruikt als initiële tem<html> Plaat voor de 3D-verfijning (MERIDIEN), waardoor een reconstructie van 3,5 Å (0,143 criterium) ( Protocol Stap 7 ) van slechts ~ 40.000 asymmetrische eenheden ( Figuur 4 ) wordt verkregen. Deze kaart met bijna atoomresolutie is binnen 24 uur verkregen, met gebruik van maximaal 96 CPU&#39;s voor de stappen van de workflow die profiteren van meerdere kernen. Voor de 3D-variabiliteitsanalyse ( protocolstap 8) werden alleen 2.000 deeltjesbeelden per groep gebruikt in stap 8.3.3 ( dwz het proces begint met 5 initiële 3D-groepen) en 200 afbeeldingen voor de kleinste groepsgrootte in stap 8.3.4 vanwege Het kleine aantal deeltjes (~ 10.000). Uit de analyse bleek gelokaliseerde flexibiliteit voornamelijk in het N-terminale gebied van het complex dat de His-tag bevat die gebruikt werd voor zuivering ( Figuur 5a ). In feite werden twaalf N-terminale resten en de His-tag niet opgelost in de eerder gepubliceerde kristalstructuur van TcdA1&quot;&gt; 22 en dit meest waarschijnlijke versteurde gebied bleef onopgelost in de huidige cryo-EM dichtheid, waarschijnlijk door de flexibiliteit ervan. Aanvullende variabiliteit werd gedetecteerd bij de receptor-bindende domeinen en het BC-bindende domein ( Figuur 5a ). Bevredigende resolutie van de structuur en de vrij kleine omvang van de dataset, werd deze heterogeniteit besloten tolerant te zijn en daarom werd geen gefocuste 3D classificatie 23 uitgevoerd. Ten slotte werd de lokale resolutie van de einddichtheidskaart berekend ( protocol stap 9.1, figuur 5b ) en de gespleten 3D-kaart werd lokaal gefilterd ( protocol stap 9.2) . Een volume van deze kwaliteit kan gebruikt worden voor de novo modelbouw met behulp van Coot 24 of een ander verfijningsinstrument ( Figuur 6 ). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Sterk&gt; Afbeelding 1: Beeldverwerking met SPHIRE. (A) De GUI van het SPHIRE softwarepakket. Een specifieke stap van de workflow kan geactiveerd worden door het respectievelijke pictogram aan de linkerkant van de GUI te selecteren (&quot;workflow step&quot;). De commando&#39;s en hulpprogramma&#39;s die geassocieerd worden met deze stap van de workflow worden weergegeven in het centrale gedeelte van de GUI. Nadat u een van de commando&#39;s hebt geselecteerd, worden de respectieve parameters in het rechter gedeelte van de GUI weergegeven. Geavanceerde parameters vereisen gewoonlijk geen wijziging van de standaardinstellingen. ( B ) Stadiums in de workflow van single particle image processing met behulp van de SPHIRE GUI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> Figuur 2: Motion Correction and ParticLe extractie. (A, b ) Typische hoogwaardige, lage dosis, gedreven gecorrigeerde digitale micrograaf opgenomen bij een defocus van 1,7 μm. Let op dat de isotrope Thon-ringen zich uitbreiden tot een resolutie van 2,7 Å in het stroomspektrum (a) en de goed waarneembare deeltjes in het 2D-beeld ( b ). ( C ) Partikel selectie met behulp van e2boxer. Groene cirkels geven aan geselecteerde deeltjes aan. ( D ) Typische ruwe deeltjes geëxtraheerd uit de dosisgewogen micrograaf. Schaalstaven = 20 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> Figuur 3: 2D Clustering en Initiële Model Generatie. (A) Galerij van 2D-klasgemiddelden, met meerderheid van zijaanzichten o<html> F het deeltje Schaalbalk = 20 nm. ( B ) Ab initio 3D-kaart van TcdA1 verkregen met RVIPER uit de referentievrije klassengemiddelden. ( C ) Vaste lichaamspas van de TcdA1 kristalstructuur (linten) (pdb-id 1VW1) in de initiële cryo-EM-dichtheid (transparant grijs). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> Figuur 4: Cryo-EM 3D Structuur van TcdA1. (A, b ) Definitieve 3,5 A dichtheidskaart van TcdA1 berekend met gebruik van ~ 9.500 deeltjesafbeeldingen: ( a ) zij- en ( b ) bovenaanzicht. ( C ) Representatieve gebieden van de cryo-EM dichtheid voor een a-helix en een β-vel.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> Figuur 5: Variabiliteitsanalyse en Lokale Resolutie. (A) Oppervlakte van de geslepen TcdA1 cryo-EM kaart (grijs) en de variabiliteitskaart (groen). Voor betere duidelijkheid werd de variabiliteitskaart laagdoorlaat gefilterd naar 30 Å. ( B ) Oppervlakteweergave van de TcdA1 scherpe Cryo-EM kaart gekleurd volgens de lokale resolutie (Å). Let op de topologische overeenkomst tussen gebieden met hoge variabiliteit en lage lokale resolutie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> Figuur 6: 3D ModEl Gebouw van TcdA1 met behulp van Coot. Representatieve gebieden van de cryo-EM-dichtheid en het atoommodel worden getoond voor een a-helix. Het atoommodel werd gebouwd de novo met behulp van Coot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE at JoVE.com

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Semi-automatische Biopanning van bacteriële Display bibliotheken voor Peptide affiniteit reagens detectie en analyse van de resulterende isolaten

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Hoge-resolutie Complexome profilering door Cryoslicing BN-MS analyse

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Handmatige Blot-and-Plunge Freezing van biologische monsters voor cryogene elektronenmicroscopie met één deeltje

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Advancing High-Resolution Imaging of Virus Assemblies in Liquid and Ice

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Interest in liquid-electron microscopy (liquid-EM) has skyrocketed in recent years as scientists can now observe real-time processes at the nanoscale. It ...